不同培养基对人外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应
漂星 景 题 由 课 广州市科委资助 ，
为重点面上项 目． 资 助 金 额 １ 万 ５ 元， 目前 已完 成 了
单位 ： 方 医科 大 学 附属 南方 医院肿 瘤 中 南
０ 引 言
心。
材料 ：实验 于 ２ ０ — ５１ ０ ６ ０ ／０在 南方 医 院肿
树 突状 细 胞 是 抗 原 递 呈 功 能最 强 的抗 原 瘤科 生物 室 完成 。 对象 ： Ａ Ａ ① ＨＬ — ２基 因亚 型 的 递 呈 细 胞 ， 直 接 抗 肿 瘤 效 应 ， 其 可 将 摄 取 健 康 自愿供 血 者 １名 ，对本 实验 知 情 同意 ， 无 但 实
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人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定
人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定杨志梅;符州;王莉佳;陈艳【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2008(25)5【摘要】在重组人粒.巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用下体外诱导培养人外周血单核巨噬细胞,并进行鉴定和功能检测.Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMc),含10%胎牛血清的RPMll640培养基和rhGM-CSF培养7d.光镜、扫描电镜及透射电镜观察细胞形态,鸡红细胞吞噬试验检测吞噬功能,流式细胞术检测单核巨噬细胞表面特征性标志CDl4等生物学技术鉴定贴壁细胞性质.获得的贴壁细胞具备巨噬细胞的形态学特征及免疫表型.有吞噬功能,纯度较高.人外周血单核细胞在rhGM-CSF诱导下向巨噬细胞分化,具有生物学活性,纯度较高.是一种简单易行的体外诱导培养巨噬细胞的方法.【总页数】3页(P66-68)【作者】杨志梅;符州;王莉佳;陈艳【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院,重庆,400014【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定 [J], 叶双樱;陈礼平;武蓉珍2.人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定 [J], 颜汝平;周海滨;李翀;王剑松;王伟;赵献3.健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定 [J], 林东军;方志刚;华佳叶;刘相富;黄仁魏4.人外周血树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的鉴定 [J], 张云飞;范清宇5.人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究 [J], 孙梯业;颜伟;孙冬丽;刘全达;段伟宏;周宁新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人外周血树突状细胞的体外培养及其影响因素的研究
ｔｅ ｅ ｗ ｒ ａ ｇ ｕ ｅ ｆＤ ｉｈ ｌ ｇ ｕ ｔ ｈ ｃ ｏ ｄ ｓｉ ｌ ａｅ ｐ ｏｉ ｒ ｔ ｎ ｏ ｌｇ ｎ ｉ Ｔ ｌｍｐ ｏ ｙｅ ． Ｉ ｄ ｉ ｏ ｈ ｒ ｅ ｅ ａｌ ｒ ｅ ｎ ｍｂ ｒｏ Ｃｓｗ ｔ ｌ ｈ ｐ ｒ ｙ ｗ ｉ ｈ ｃ ｕ ｔ ｉ ｉ ｌ ｍｕ ｔ ｒ ｌ ｅ ａｉ ｆａ ｏ ｅ ｅ ｃ ｙ ｈ ｃ ｔ ｓ ｎ ａ ｄ ｔ ｎ， ｔｅ ｆ ｏ ｌ ｉ ｈ ｃ ｔ ｅ ｏ ｓｃ ｎ ｂ ｎ ｕ ｎ ｅ ｙ ｂ ｏ ｄ ｓ ｕ ｄ ｔ ｅ ｄ ｎ ｉｙ ｏ ｙ ｏ ｉ ｅ ． ｌｒ ｕ ｕ ｆＤＣ ａ ｅ ｉｆ ｅ ｃ ｄ ｂ ｌｏ ｔ ｍｓ ａ ｈ ｅ ｔ ｆｃ ｔ ｋ ｎ ｓ ｌ ｅ ｎ ｓ Ｃ ｎ ｌ ｓｏ ｓ Ｄ ｓ ｃ ｎ ｂ ｕｔ ｒ ｄ ｆｏ Ｐ ｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｃ ａ ｅ ｃ ｕ ｅ ｒ ｍ ＢＭＣｓ ｌ ，
TRAF6在人PBMC来源的树突状细胞成熟中的作用
TRAF6在人PBMC来源的树突状细胞成熟中的作用刘璐;李琳;闵军;王捷;伍衡;曾育杰;陈双;褚忠华【摘要】目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在不同成熟度树突状细胞(DCs)中的表达及其对DCs免疫刺激活性的影响.方法:重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(IL-4)体外诱导的人外周血单个核细胞来源的DCs,经TNF-α、LPS和细胞因子鸡尾酒法诱导成熟,分别以流式细胞术、ELISA和混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs的表面标志、IL-12分泌和刺激淋巴细胞增殖能力.Western blotting和real-time PCR分别检测各组TRAF6蛋白水平及mRNA的表达.结果:各组DCs均表达TRAF6,成熟状态最佳的鸡尾酒诱导下DCs的TRAF6蛋白表达最高.高表达TRAF6的DCs可促进IL-12的分泌,增强刺激淋巴细胞增殖的能力.结论:TRAF6是调节DCs激活和成熟的关键因素.%AIM: To investigate the immunological effect of tumor necrosis factor receptor - associated factor 6 ( TRAF6 ) on the maturation of dendritic cells in vitro.METHODS: The human peripheral blood mononuclear cell ( PBMC ) - derived dendritic cells ( DCs ), induced by recombined human granulocyte macrophage colony - stimulating factor ( GM - CSF ) and interleukin ( IL ) - 4, were stimulated to mature with TNF - α, LPS or cocktail of cytokines ( TNF - α, IL - 6, IL - 1 β and PGE2 ).The cell surface markers, T - cell stimulatory proliferation capacity and IL - 12 p40 production of the DCs were determined by the methods of flow cytometry, ELISA and mixed lymphocyte reation ( MLR ), respectively.The mRNA expression of TRAF6 was detected by real - time PCR.RESULTS: The expression of TRAF6 was observed in all groups, which in cocktail group was the highest in the DCswith optimum state of maturation.Furthermore, TRAF6 enhanced the production of IL - 12 and the ability of T - cell stimulation of mature DCs.CONCLUSION: TRAF6 might play an important role in inducing the maturation of human PBMC - derived DCs.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2011(027)009【总页数】5页(P1767-1771)【关键词】树突细胞;肿瘤坏死因子受体相关因子;细胞因子【作者】刘璐;李琳;闵军;王捷;伍衡;曾育杰;陈双;褚忠华【作者单位】中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院妇产科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科,广东,广州,510120;中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科,广东,广州,510120【正文语种】中文【中图分类】R363肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor－receptor associated factor，TRAF)是肿瘤坏死因子超家族和Toll样/白细胞介素－1受体(interleukin－1 receptor，IL－1R)超家族重要的接头分子，在天然免疫和获得性免疫中发挥了重要的作用[1]。
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定目的：研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法。
方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养，动态地观察贴壁细胞的生长状况，免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达。
结果：人外周血单个核细胞经体外培养至第2天，呈贴壁生长，细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物，形态呈蝌蚪样改变，部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长，呈梭形改变，细胞间相互围绕呈环形，并有集落出现，免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性。
结论：运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增。
标签：内皮祖细胞；外周血；细胞培养内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞（angioblast），EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生过程。
近些年来人们对EPCs在血管形成、心脑血管疾病和创伤愈合等方面的作用进行了广泛的研究[1]，EPCs移植技术已成为治疗心脑血管疾病的一种新兴的方法[2]，具有广阔的临床应用前景。
但由于EPCs的来源有限，目前的培养方法尚不能满足基础研究和临床治疗的需要，在本实验中，笔者研究从来源相对广泛的人外周血中分离培养EPCs，为EPCs的应用提供一种便捷有效的分离方法。
1 材料和方法1.1 材料：主要试剂和仪器：内皮细胞培养基（Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2）（Lonza公司）。
人淋巴细胞分离液（天津灝洋生物制品有限公司）。
鼠抗人CD133单克隆抗体、血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）（北京博奥森生物技术有限公司）。
不同诱导方法对人外周血树突状细胞体外成熟的影响
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃｖ Ｔ ｖｓｇｔ ｔ ｍ ｎｙｅｅ ｆ ｉｅ ｎ ｃｔ ｉ ｎｉｍ ｔ ｅ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔｅ ｏｉ ｅｉ ｅ ｈ ｉ ｕｉ ｆｃ ｏ ｄｆｅｔ ｙ ｋ ｅｏ ａ ｒ ｉ ｎ ｔａ ｅ ｍ ｔ ｆｔ ｆｒ ｏ ｎ ｍ ｕ
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・
不 同诱 导方法对人外 周血树 突状 细胞体 外 成 熟 的影 响
刘璐 李琳 伍 衡 闵军 王 捷 曾 育杰 褚 忠华
探讨 不 同诱 导方式对 于体外 培养 的树突状 细胞 （ｅｄｔ ｌ ，Ｃ 免疫刺 激 ｄｎｒｉｃ ｌ Ｄ ） ｉ ｅｓ ｃ
通过 ｒＧ Ｃ Ｆ和 Ｉ一 ｈ Ｍ． Ｓ Ｌ４体外诱 导 的人外周 血单核细胞来 源 的 Ｄ 分别用肿 瘤 Ｃ，
标 记 小 鼠 抗 人 Ｃ ８ 与 ＨＬ ． Ｄ３ ＡＤＲ、 异 硫 氰 酸 （ｕｒｃｉｉ ｔｉｃａａｅＦＴ ） ｌ ｆ ｏｅｅｎｓ ｈｏｙｎｔ，ＩＣ 标记 小 鼠抗 人 Ｃ ８ 、 ｏ Ｄ ６
人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究
・５ ６１・
人 外 周 血 来 源树 突 状 细 胞 的诱 导 及 培 养 方 法 的研 究
张 秀敏 曲 萍 郭风 袁媛 王净 王超 王 慧 （ １第四 军 医大学基础 部 病理 与病理 生理 学教研 室 ； 四军 医大 学教 学实验 中心 ； ２第 ３第 四军 医大 学西京 消化 病 医院 陕西 西安 ７０３ ） １０２
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文章编号（Article ID）：1009－2137（2011）04－1010－05·论著·不同培养基对人外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响陈晨，刘元林，梁晓雷，朱恒，李红，吴英，毛宁，张毅军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室，北京100850摘要本研究旨在探讨RPMI1640和IMDM两种培养液对诱导人外周血单核细胞向树突状细胞（DC）发育分化的影响。
利用GM-CSF+IL-4细胞因子组合，在培养条件一致的前提下，改变培养液种类，通过对成熟、未成熟DC形态观察，用流式细胞术检测细胞表型和吞噬能力、应用混合淋巴细胞反应（MLR）检测其刺激T细胞的增殖能力，用悬浮芯片技术检测DC与同种异体T细胞共培养后上清中所含细胞因子的变化，分析不同培养液对DC功能的影响。
研究结果表明，两种培养液培养所得的DC在形态上无显著差异，DC的吞噬能力以及CD14和CD83的表达亦无显著差异，但应用IMDM培养的DC的CD1a表达明显降低，且对T细胞增殖的刺激能力也显著降低；IMDM培养的DC高表达IL-6、IL-8和IL-10，而IL-12的表达则显著降低。
结论：不同的培养体系可获得功能不同的DC，IMDM培养的DC可能与免疫耐受有关，本研究结果为DC在临床上的应用提供了新思路。
关键词RPMI1640；IMDM；单核细胞；树突状细胞中图分类号R329．28文献标识码AEffect of Different Culture Mediums on the Development of Monocyte-derived Dentritic CellsCHEN Chen，LIU Yuan-Lin，LIANG Xiao-Lei，ZHU Heng，LI Hong，WU Ying，MAO Ning，ZHANG Yi Department of Cell Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Beijing100850，ChinaCorresponding Author：ZHANG Yi，Professor，Senior Scientific Researcher．Tel：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn Abstract This study was aimed to investigate the effect of RPMI1640and IMDM on the development of human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells．Under the same cytokines and culture conditions，the different medium types were tested，and the morphology of mature and immature dendritic cells was observed by microscopy，the cell phenotype and endocytosis ability were detected by flow cytometry．Furthermore，the immunoregulatory function of various DC was analyzed by mixed lymphocyte reaction（MLR），the expression of cytokine in culture supernatant of MLR system was also analyzed by Bio-plex technology．The results showed that there were no difference in morphology，CD14，CD83 expression and endocytosis ability between IMDM-cultured DC and RPMI-1640medium-cultured DC，but there was a lower expression of CD1a in IMDM-cultured DC．Moreover，DC cultured with IMDM displayed a significant reduction in stimulating T cell proliferation，and highly expressed IL-6，IL-8and IL-10，but low expressed IL-12．It is concluded that the different cultural mediums can induce DC with different functions and DC cultured with IMDM may correlated with induction of immune tolerance．The results of this study will provide a new idea for DC clinical application．Key words RPMI1640；IMDM；monocyte；dentritic cellJ Exp Hematol2011；19（4）：1010－1014树突状细胞（dendritic cells，DC）作为一种重要的免疫辅佐细胞，是体内最强的抗原呈递细胞。
它最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞，激发机体免疫反应，在诱导免疫应答中起关键作用［1］。
因此DC在人类重大疾病（如肿瘤、移植免疫等）的发病和治疗中具有重要的研究价值。
由于DC在体内含量很低，约占白细胞总数的1%－2%，且缺乏特异性的表面分子加以识别与纯化，因此近年来有关DC种类和功能的研究成为焦点。
目前有关DC来2+造血干细胞来源的DC，另一种是外周血单核细胞来源的DC。
体外培养DC的培养液为RPMI1640［2，3］，结合粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor，GM-CSF）和白介素4（interleukin-4，IL-4），可诱导获得CD1a+CD83+具有抗原呈递功基金项目：国家重点基础研究资助项目（编号2010CB833604）；国家自然科学基金面上项目（编号31070996通讯作者：张毅，教授、研究员．电话：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn2011－02－14收稿；2011－03－29接受·0101·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2011；19（4）：1010－1014能的DC。
另外，近年人们发现还有一种具有免疫耐受作用的DC。
初步研究结果显示，在免疫抑制因子的刺激下，可诱导获得具有抑制体内免疫反应的DC，在移植免疫和自身免疫性疾病的治疗中将发挥重要作用。
有关如何获得免疫耐受型DC成为当前DC领域的研究热点，为此本研究试图通过改变培养液种类，结合细胞因子配伍，探讨诱导人外周血单核细胞向耐受型DC的发育分化，为临床应用以及后续研究提供实验依据。
材料和方法材料与试剂IMDM和RPMI1640液体培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司；重组人GM-CSF和重组人IL-4均购自Pepro Tech公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自天津血液病研究所；Monocyte isolation kit MiniMACS、Pan T isolation kit MiniMACS购自Miltenyi Biotec公司；流式细胞术相关鼠抗人单克隆抗体CD1a-FITC、CD14-PE、CD83-PE购自BD PharMingen公司；葡聚糖FITC-Dextron购自Sigma 公司；Bio-Plex细胞因子检测试剂盒购自北京BioRad公司；健康供者外周血由军事医学科学院附属307医院血库提供。
DC的培养与形态表型鉴定取正常人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后按照Monocyte isolation kit MiniMACS说明分离CD14+细胞，分别用含10%FBS的IMDM和RPMI 1640完全培养液重悬，调整细胞浓度为1ˑ106/ml，细胞因子配伍为GM-CSF50ng/ml，IL-450ng/ml，种于6孔板中，每孔终体积2ml，于37ħ、5%CO2孵箱内培养，每3天半量换液，培养至第5天，显微镜下观察细胞形态。
同时，向培养5天的培养体系中加入LPS（1μg/ml）刺激细胞成熟，至第7天时在显微镜下观察细胞形态。
另外，收集培养至第5天的未成熟DC （immature DC，iDC）和加入LPS刺激后培养至第7天的成熟DC（mature DC，mDC），分别标记抗体CD14-PE、CD1a-FITC、CD83-PE，用流式细胞仪检测其细胞表型变化。
DC吞噬能力的检测收集用不同培养液培养的iDC和mDC，每管1ˑ106/ml，分别于37ħ（实验组）和0ħ（对照组）孵育1560分钟，用冷PBS终止实验，洗涤后上流式细胞仪检测吞噬效率。
不同DC刺激T细胞增殖能力的混合淋巴细胞反应（MLR）检测应用混合淋巴细胞的反应（MLR）方法进行检测，取健康志愿者外周血，分离单个核细胞，按Pan T细胞免疫磁珠分离试剂盒说明分离CD3+细胞，用含20%FBS的IMDM和RPMI1640培养液分别重悬CD3+细胞，调整细胞浓度为2ˑ106/ml，在96孔板中加入100μl/well作为反应细胞；以30Gy照射后的2种不同培养液培养出的iDC和mDC为刺激细胞。
反应细胞数目不变，将刺激细胞按一定的梯度浓度与反应细胞混合后悬浮于含20%FBS的IMDM或RPMI1640培养液中，在37ħ、5%CO2孵箱内培养96小时，培养结束前16小时加3H-TdR 1μCi/well。
收集细胞，用液体闪烁仪检测cpm值。
细胞因子表达的悬浮芯片法检测收集混合淋巴细胞反应体系中的培养上清，按照BioRad公司悬浮芯片检测细胞因子说明，检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的表达。
统计学分析应用Excel软件进行统计分析，数据以珔XʃSD表示，均数比较用双尾t检验，校验水准α=0．05，p＜0．05有统计学意义。
结果不同培养液对DC发育分化的影响从倒置显微镜下观察细胞形态可以看出，在培养初期RPMI1640培养液培养的DC较IMDM培养的DC形态均一，但随着培养时间的延长，IMDM培养的细胞形态也逐渐均一。