硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
分级沉淀实验报告
一、实验目的1. 了解分级沉淀的基本原理和方法；2. 掌握通过改变溶液中离子强度和pH值来分级沉淀蛋白质的技术；3. 学习利用分级沉淀技术从混合物中分离和纯化蛋白质。
二、实验原理分级沉淀是一种利用溶液中离子强度、pH值、有机溶剂等因素改变蛋白质溶解度的方法，从而实现蛋白质的分级沉淀。
蛋白质在不同离子强度、pH值下的溶解度不同，因此可以通过调整这些条件，使蛋白质在溶液中的溶解度发生变化，从而实现分级沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白质样品：猪肝匀浆、鸡蛋清等；（2）试剂：硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、醋酸等；（3）溶剂：蒸馏水、甲醇等。
2. 实验仪器：（1）离心机；（2）pH计；（3）分光光度计；（4）容量瓶；（5）移液器。
四、实验步骤1. 蛋白质样品制备：将猪肝匀浆或鸡蛋清等蛋白质样品用蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 离心分离：将稀释后的蛋白质样品离心分离，取上清液作为实验样品。
3. 分级沉淀：（1）硫酸铵分级沉淀：将离心后的蛋白质样品加入不同浓度的硫酸铵溶液，使蛋白质在硫酸铵溶液中发生分级沉淀。
分别取不同浓度的硫酸铵溶液，将蛋白质样品进行沉淀，收集沉淀物，并用蒸馏水洗涤沉淀物。
（2）氯化钠分级沉淀：将洗涤后的蛋白质沉淀物用蒸馏水溶解，加入不同浓度的氯化钠溶液，使蛋白质在氯化钠溶液中发生分级沉淀。
分别取不同浓度的氯化钠溶液，将蛋白质样品进行沉淀，收集沉淀物，并用蒸馏水洗涤沉淀物。
（3）pH值分级沉淀：将洗涤后的蛋白质沉淀物用蒸馏水溶解，调节溶液pH值，使蛋白质在pH值变化下发生分级沉淀。
分别取不同pH值的溶液，将蛋白质样品进行沉淀，收集沉淀物，并用蒸馏水洗涤沉淀物。
4. 沉淀物鉴定：利用分光光度计测定沉淀物的吸光度，分析不同条件下蛋白质的沉淀情况。
5. 沉淀物回收：将洗涤后的沉淀物进行离心分离，收集沉淀物，并用蒸馏水洗涤沉淀物。
五、实验结果与分析1. 硫酸铵分级沉淀：随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质的溶解度逐渐降低，沉淀量逐渐增加。
硫酸铵沉淀蛋白质方法
硫酸铵沉淀蛋白质方法硫酸铵沉淀蛋白质方法是一种常用的蛋白质纯化方法，通常被用于分离和浓缩蛋白质。
本文将从硫酸铵沉淀蛋白质的原理、步骤、优缺点及注意事项等方面进行介绍。
一、硫酸铵沉淀蛋白质原理硫酸铵沉淀蛋白质法是根据不同蛋白质在一定盐度和pH 值下的溶解度差异而进行的蛋白质分离、富集和纯化方法。
在适宜的浓度下，硫酸铵可使一些蛋白质（多为大分子蛋白质）发生酸性沉淀，而不影响小分子的低分子量蛋白质。
这是因为硫酸铵分子从溶液与蛋白质结合，降低蛋白质的有效离子浓度，使蛋白质失去溶解度而发生沉淀。
二、硫酸铵沉淀蛋白质步骤硫酸铵沉淀蛋白质的步骤大致分为预处理、沉淀和洗涤、脱盐和保存等步骤。
1. 预处理将待纯化的样品通过超声波或搅拌等方法打散，去除杂质，并加入适量的缓冲液进行 pH 值的调节。
调节 pH 值的考虑因素包括离子强度、盐度、亲水性等。
2. 沉淀和洗涤加入硫酸铵至搅拌后样品中，反复搅拌，将待纯化的蛋白质沉淀出来。
这其中的具体步骤可在下文中详细介绍。
待沉淀后进行洗涤处理，以去除杂质和溶质，获得较纯的蛋白质。
3. 脱盐和保存向蛋白质样品中加入脱盐液，进行脱盐，使蛋白质完全溶解。
将蛋白质溶液过滤并保存。
三、硫酸铵沉淀蛋白质优缺点优点：1. 适用性广，大多数蛋白质都可以通过硫酸铵沉淀方法来纯化。
2. 操作简单，不需要高级技术和设备。
3. 此方法不会破坏蛋白质的天然结构和功能性。
缺点：1. 蛋白质沉淀不纯，沉淀物中可能含有许多不同的蛋白质，同时有许多不溶性物质，需要进行再次分离。
2. 操作难度在某些情况下会受到蛋白质和样品特性的限制。
四、硫酸铵沉淀蛋白质注意事项1. 操作中需严格控制缓冲液的 pH 值，保证硫酸铵完全溶解。
2. 反复搅拌时需小心操作，以免造成样品的脱失。
3. 沉淀和洗涤处理时需要保持低温，以孕育样品质量。
4. 注意沉淀物的分离和收集，防止样品中的不溶性溶质附着在上面。
5. 注意保存样品至干燥处。
掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术原理
材料用具
鲜牛奶
醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液其配制如下： ①配A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAc· H2O 5.44g 溶至200ml。 ②配B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优级纯醋酸2.4g溶 至200ml。 ③取A液约17.7ml，B液约12.3ml混合，用酸度计调得 pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液30ml。
（三）pH
有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定 的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低 的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析 的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在 等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避 免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的 发生。
（四）离子强度
在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小， 物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。 盐的浓度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量 的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有 机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度 时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解 度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既 能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定 的保护作用，防止变性。
操作方法
等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白
5、在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。 将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。 用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用 乙醚洗沉淀2次，抽干。 6、将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋 白纯品。 7、准确称量，计算含量和收率。 含量=酪蛋白g/100mL牛乳
有机溶剂沉析的应用
（一）有机溶剂沉析的特点
优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只 在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱 盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作需在低温下进行。
硫酸铵的鉴定实验报告
硫酸铵的鉴定实验报告沉淀反应实验报告实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、ph试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、millon’s试剂：40g汞溶于60ml 浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%cuso：1g cuso晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 446、10%naoh：10g naoh溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一）米伦（millon’s）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml 于试管中，加millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。
硫酸铵沉淀蛋白质原理
硫酸铵沉淀蛋白质原理
硫酸铵沉淀蛋白质是常用的蛋白质分离和纯化方法之一。
该方法
的原理是利用硫酸铵盐溶液中的盐度效应，调节蛋白质水合层，使蛋
白质失去溶解性沉淀出来。
硫酸铵的加入将水合壳破坏，蛋白质的疏
水部位暴露出来，因而沉淀，从而实现了对蛋白质的分离和提纯。
硫酸铵沉淀蛋白质的具体操作步骤如下：首先，将待提取的蛋白
质样品加入适量的硫酸铵盐溶液中并充分搅拌，一般可选取25%、35%、50%、60%和75%等不同浓度的硫酸铵盐溶液。
然后，待溶液静置约30
分钟后，离心沉淀。
最后，可通过去除上清液、冲洗、离心等方式获
得沉淀的蛋白质。
硫酸铵沉淀蛋白质原理
硫酸铵沉淀蛋白质原理蛋白质是生命体内最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能方面发挥着重要作用。
蛋白质的分离和纯化是生物学和生物化学研究的基础，而硫酸铵沉淀法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
硫酸铵沉淀法是一种基于蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度变化的原理。
蛋白质在水中的溶解度受到其氨基酸成分和结构的影响，不同的蛋白质在不同的条件下溶解度也不同。
硫酸铵是一种常用的盐类，可以在一定浓度下沉淀蛋白质。
硫酸铵沉淀法的原理是，通过逐渐增加硫酸铵的浓度，使得蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中的溶解度发生变化，从而实现蛋白质的分离和纯化。
硫酸铵沉淀法的步骤如下：1. 将待分离的混合物加入到一定浓度的硫酸铵溶液中，并在室温下搅拌一段时间，使得蛋白质逐渐沉淀。
2. 将悬浮液离心，将上清液倒掉。
3. 用一定浓度的硫酸铵溶液洗涤沉淀，去除杂质。
4. 用一定浓度的硫酸铵溶液重悬沉淀，使其重新溶解。
5. 将重悬液进行透析或柱层析等纯化方法，得到纯化的蛋白质。
硫酸铵沉淀法的优点是简单易行，操作方便，不需要昂贵的设备和试剂，适用于大规模蛋白质分离和纯化。
同时，硫酸铵沉淀法可以同时分离多种蛋白质，因此也常用于蛋白质组学等领域的研究。
然而，硫酸铵沉淀法也存在一些缺点。
首先，硫酸铵沉淀法不能有效地分离水溶性和不溶性蛋白质。
其次，在硫酸铵沉淀的过程中，蛋白质可能会发生部分失活或降解，影响其纯度和活性。
此外，硫酸铵沉淀法也不能有效地分离具有相似分子量或等电点的蛋白质。
总之，硫酸铵沉淀法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，其原理基于蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度的变化。
虽然硫酸铵沉淀法存在一些缺点，但其简单易行的特点使得它在大规模蛋白质分离和纯化方面具有广泛的应用前景。
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理和操作及配比用表要慢慢把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。
因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些非极性区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。
一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。
因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，注意实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，弄清楚需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积。
用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：1. 造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。
不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2. 操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。
然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀法的基本原理:这是一种从大量粗制品中提取并部分提纯蛋白质的方法。
主要是通过将免疫球蛋白从试样中分离，通常采用的方法是：高浓度的盐离子蛋白溶液和蛋白质的水分子发生竞争，导致其水和蛋白质分子减弱，通过溶解度从溶液沉淀出来。
因不同的蛋白质溶解度相同，所以用相同的盐溶液进行沉淀，称为盐析。
盐的含量一般用饱和度来表示，而硫酸铵由于具有较高的溶解度，较低的温度系数，容易引起蛋白的变性，因此得到广泛的应用。
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一，基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器
1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等
2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4
3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）
4. 蒸馏水
5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)
6. 透析袋
7. 超速离心机
8. pH 计
9. 磁力搅拌器
三，操作步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）
1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.
2.其它不同饱和度铵溶液的配制
（二）沉淀
1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积；
3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析
1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；
2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对
PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
四，应用提示
（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4 °C ）；
3.3000 ′g 离心30 min （4 °C ），保留上清液；上清液再加SAS 到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。
因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。
一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。
因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机
这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。
此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：
1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液
利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。
不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。
然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。