SOD提取纯化
SOD的提取
1.原料的预处理
2.粗酶液的制备
3.离子交换层析
SOD动物血提取方案
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原材料价格
从动物血中提取SOD 啤酒酵母中提取SOD 刺梨子中提取SOD 玉米中提取SOD
提取工艺成本
产品纯度
产品的酶比活力 工业生产能力
几种提取工艺的比较
几种SOD原料的优劣
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SOD的纯度测定
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Leon
SOD提取
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SOD用途
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动物血
简介
植物
用途 提取
SOD提取
SOD
微生物
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从动物血中提取SOD
加入 K 2 HPO4 3H 2O(43g / 100ml) 提取新鲜动物血液加入体积1/3的 转移至分液漏斗震荡后静置15min 将透析完全的粗酶液离心去沉淀 收集上层液，4000r/min离心20min 柠檬酸钠抗凝剂，4000r/min离心 用聚乙二醇进行适当浓缩 取上清液。 20min。收集红细胞。 装填DEAE Sephadex A-50层析 加入0.75体积冷丙酮，4000r/min 向红细胞中加入等体积的 6% 柱。装填平衡完毕后准备pH7.6 离心20min收集沉淀。 X-100） Triton X-100（曲拉通 2~200mmolPBS，进行梯度洗 充分搅拌20min。 加入少量重蒸水，55℃热处理 脱。 15min，后迅速冰浴至 4℃冰箱中冻融4h。 梯度洗脱的流速在40ml/h 4℃并4000r/min离心 加入0.25体积的乙醇和 收集器转速为6min/管。 20min，弃沉淀。 0.15体积的氯仿搅拌 收集波峰溶液浓缩后干燥 pH7.6透析浓缩 15min后离心取上清液 得到淡蓝绿色产品。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化实验报告
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果的综合影响一、摘要：通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。
二、关键词：SOD 连苯三酚自氧化法SOD酶活性测量透析除盐三、前言：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。
能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
四、实验技术路线：我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间。
经过40%的硫酸铵和50%的硫酸铵作用过后的提取液，得到40%的上清和沉淀，50%的上清和沉淀。
然后分别测定这4份样品的SOD酶活力，来推理出硫酸铵沉淀区间。
五、材料和试剂：绿豆（实验使用前需先用蒸馏水浸泡20h）；连苯三酚（使用时需先稀释5倍）；硫酸铵（粉末）；Tris-HCL缓冲液；蒸馏水。
六、仪器：匀浆机；低温离心机；分光光度计；移液枪；500ml量筒；纱布；烧杯和试管若干。
七、实验步骤：1、取30g绿豆，并加入300ml蒸馏水，用匀浆机匀浆。
2、匀浆出来的豆液用二层纱布过滤，离心（5℃，3000rpm / 8min）取上清液，取1ml上清液测量其总活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法），其余量取150ml分装成两支各75ml。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术
实训三超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术一、实验原理：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸，乙醇（AP），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨酸( methionine) , NBT（氮兰四唑Nitroblue Tetrazdinna）, 核黄素 , EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）,<三>仪器:离心机WFZ-UV2000 型紫外分光光度计201×7（717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、移液管、玻璃棒、<四>实验方法和步骤：1.称量25g 绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）15Min 取清液，取少量样为样①，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。
2.所得清液测量总体积，缓慢40％饱和（NH4）2SO4 至浓度为19.4g/100ml，4℃冰箱静置分层。
3.离心（3000rpm）取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。
4.步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充分搅拌），5℃至分层，离心（3000rpm）取沉淀，取样③，计算SOD总活性单位及活性单位。
sod的提取方法2篇
sod的提取方法2篇
【SOD的提取方法】
SOD是一种重要的抗氧化酶，其含量和活性对人体健康至关重要。
本文将介绍两种常用的SOD提取方法。
一、超声波辅助提取法
该方法利用超声波加速细胞壁破裂，以提高SOD的提取率和活性。
具体步骤如下：
1.将待提取的样品放入离心管中，加入PBS缓冲液，离心后收取细胞沉淀。
2.加入含有各种离子的络合物，使其与SOD结合复合物。
可以使用EDTA、葡萄糖酸等离子络合物。
3.将管子放入超声波水浴中，加热至60℃，持续20min。
超声波振动会导致细胞壁破裂，SOD会被释放到缓冲液中。
4.离心去除残渣，收取上清液。
5.对上清液进行酶活测定，确定SOD含量和活性。
二、抑制剂竞争法
该方法采用的是竞争配位作用，使SOD与自身抑制剂分开，从而纯化出SOD。
具体步骤如下：
1.将待提取的样品放入离心管中，加入含有酸和盐的缓冲液进行破壁。
2.加入Ni-NTA亲和剂，使SOD与亲和剂结合。
然后加入SOD自身抑制剂（如H2O2），形成结合复合物。
3.用Imidazole缓冲溶液等弱配位剂进行洗涤，将非特异性蛋白质去除。
4.采用大量Imidazole或其他较强的配位剂，使SOD与亲和剂分开。
分离后可用SOD酶活测定来检测提取的SOD。
以上两种方法都是基于SOD在活性和稳定性方面的不同性质而设计的。
个人认为抑制剂竞争法较为适合规模较大的SOD生产厂家，而超声波辅助提取法则适用于小规模实验室研究。
SOD提取纯化
动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化一、超氧化物歧化酶的提取［原理］1969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD 分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到吧OD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备CuZn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。
［试剂和器材］1、试剂3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮；pH7.6、2.5mmo1/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液；DEAE-SephadexA-502、器材猪血；恒温水浴；离心机；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋［方法和步骤］1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1〜1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min 离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
SOD纯化流程
SOD纯化流程一、DE22树脂处理：（处理原因：经过弱酸、弱碱将树脂上的蛋白质等洗脱下来，而后用工作液使树脂平衡，以便纯化SOD之用）1、新买来的树脂，称量后，用纯水浸泡过夜，而后处理。
（老树脂的再生一般在使用之后就处理）。
2、将上述树脂液用砂型漏斗抽去水。
取出树脂饼置放于烧杯之中。
用0.5mol/L 的盐酸溶液浸泡半小时。
浸泡过程中要适时搅拌（一般做法是每隔十分钟搅拌一次），以便酸溶液可以与树脂充分接触。
3、将上述酸泡树脂浑浊液用砂型漏斗抽去酸水。
再用适当清水浸泡，用砂型漏斗抽去水，使之接近中性，以便接下来的碱处理。
4、取出上述树脂饼，置放烧杯中。
用0.5mol/L 的氢氧化钠溶液浸泡半小时。
侵泡过程中要适时搅拌（一般做法是每隔十分钟搅拌一次），以便碱溶液能与树脂充分接触。
5、将上述碱泡树脂浑浊液用砂型漏斗抽去碱水。
再用适当清水浸泡，用砂型漏斗抽去水，使之接近中性，以便接下来的工作液平衡处理。
6、将上述树脂饼用工作液浸泡，抽去。
反复数次使树脂的pH与工作液相当。
（具体判断方法是用pH试纸分别测定工作液和砂芯漏斗抽出液的pH，二者要相当）注：此步相当重要，树脂平衡的好坏直接影响到SOD的挂靠性能。
7、平衡后，将树脂饼取出放进烧杯，用工作液浸泡。
置放于冰箱中以便上柱之用。
附：母液配制：称取K2HPO4·3H2O 41.77g ，KH2PO4 2.314g，用纯水（最好是煮沸冷却后的纯水，因为要长期保存）定容至500ml。
工作液配制：取母液10ml，用清水定容至2000ml。
二、DE22装柱1、取一根层析柱，垂直固定在铁架台上。
柱下面置放两层纱布，以防上柱后树脂堵住下面的砂芯。
2、用玻棒先抵住下面的纱布，然后将平衡后的树脂缓慢倒入层析柱中。
取出玻棒。
使树脂沉积下去。
控制柱高在11~13cm左右。
加上导管，用工作液平衡。
注意：要控制层析柱中的液面不能在树脂面之下，否则，树脂中就会存在气泡，影响分离的效果。
sod的提取方法
sod的提取方法SOD（少氧化热）是一种常见的气体提取方法，其全称为带有少氧化热工艺的溶剂萃取。
它是一种将气体从混合气中分离出来的工艺，被广泛应用于石油、化工、医药等领域。
在这篇文章中，我们将探讨SOD提取方法的基本原理、工艺步骤以及其在不同领域的应用。
首先，让我们了解一下SOD提取方法的基本原理。
SOD是通过利用溶剂的溶解能力将气体从混合气中去除的过程。
在SOD提取中，一种合适的溶剂被选择并用于将目标气体吸附或溶解，从而分离出所需的气体成分。
这种方法的基本原理是利用溶剂和气体成分之间的相互作用力，包括溶解、吸附和化学反应等，以实现气体的分离和纯化。
接下来，让我们详细了解SOD提取方法的工艺步骤。
SOD提取过程主要包括采样、溶剂选择、溶剂准备、溶剂萃取和回收几个主要步骤。
首先，需要进行准确的采样工作，以确保样品的可靠性和分析结果的准确性。
然后，在选择溶剂时，需要考虑目标气体的物理化学性质、溶解度以及溶剂的安全性和可再生性等因素。
之后，溶剂需要经过准备和调配，根据不同的实际应用需求进行适当的处理和配比。
在溶剂萃取阶段，混合气体和溶剂被充分接触和混合，通过物理或化学作用将目标气体从混合气中分离出来。
最后，通过适当的方法进行溶剂的回收和再利用，以提高溶剂的利用率和经济效益。
现在，让我们探讨一下SOD提取方法在不同领域的应用。
首先，SOD提取方法在石油工业中被广泛应用于原油的脱烃、脱硫和脱氧等工艺中。
通过SOD提取，可以有效去除原油中的杂质和有害物质，提高原油的品质和可用性。
其次，在化工工业中，SOD提取方法常被用于有机化学品的分离和纯化。
例如，在合成药物的制造过程中，通过SOD提取可以获得高纯度的药物成分，提高药物的活性和药效。
此外，SOD提取还在环境监测、食品加工和空气净化等领域有着广泛的应用。
总结起来，SOD提取方法是一种重要的气体分离技术，通过溶剂萃取的方式将气体从混合气中分离出来。
其基本原理是利用溶剂和气体成分之间的相互作用力，以实现气体的分离和纯化。
SOD的分离、纯化及酶活测定
概述
应用
分离纯化
酶活测定
2 理化性质
种类 分子量
Cu,Zn-SOD
32KD
Fe-SOD
42KD
含有金属数
1Cu,1Zn
2Fe
分子结构 分子构想 最大紫外光吸收波长
二聚体或四聚体 α-折叠折叠 258
最大可见光吸收波长
680
氨基酸组成特点 Tyr、Trp缺乏、Trp缺乏
二聚体或四聚体 β-折叠折叠 280 350
破壁
离心取上清液
SOD粗提液
丙酮二次沉淀
SOD纯品
概述
应用
分离纯化
酶活测定
2、类球红细菌SOD分离纯化
菌种的活化处理及培养
发酵液
酶法辅助超声波法
破壁
离心取上清液
SOD粗提液
丙酮分级沉淀
SOD纯品
概述
应用
分离纯化
酶活测定
3、黑脉羊肚菌SOD分离纯化
菌种的活化处理及发酵培养
发酵液
离心取上清液
SOD粗提液
值,，30s测一次，测4min，求出光密度值变化速
率ODB／min。
计算
C
酶活力
ODA ODB ODA
100% V 1
n
（U/ml）
50%
v2
敬请老师批评指 正
含Tyr、Trp、Trp
1mol/L KCN抑制抑制 H2O2处理
过氧化物酶作用 失活温度
叠氮化钠抑制
明显抑制 明显失活
有 95℃ 敏感
无 明显失活
— 80℃ 敏感
氯仿-乙醇抑制乙醇抑制
不敏感
敏感
Mn-SOD
44KD或80KD
实验提取SOD
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术摘要通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，总纯化倍数为1.87，活性得率为0.3768%。
一、前言超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶，广泛存在于各种生物中。
SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用，也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到极大关注。
SOD属于金属酶，其理化性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。
按照结合的不同金属离子，生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe—sOD三种，但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。
在已发现的酶中，超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA，使脱水酶失活，使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶(ATPase)失活，从而易引起生物体发疾病或衰老。
自从1968年McCord与Fridovich发现SOD及其催化超氧化物自由基歧化为O2与H2O以来，SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。
根据近10年的研究报告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其对机体直接或间接的损伤；使O2成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O 的水平；调节机体内NO水和催化反应产物H2O2等作用。
现在在日常生产应用中，多以动物血液中提取SOD。
但是动物血液中的疾病很多，价格也比较昂贵。
从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题，类似绿豆芽这种植物，其成本低廉，且SOD 的含量丰富，又无污染，将其大量应用于生产有着很好的发展前景。
实验四植物中超氧化物歧化酶SOD的分离纯化
实验四植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化一、实验目的1通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。
2掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。
二、实验原理（一）SOD的性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。
SOD催化如下反应： O2-+ O2-+2H+一H202+O2（二）SOD的分离提取蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。
④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。
1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。
经加热变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用DEAE-纤维素柱层析或DEAE-葡聚糖柱层析纯化，可得到更纯的酶。
经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯100倍以上。
大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。
稀盐和缓冲系统的水溶液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
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动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化动物血中超氧化物歧化酶的提取[原理]l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。
[试剂和器材]1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）DEAE-Sephadex A-502、器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋[方法和步骤]1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（3）热变性上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（4）沉淀清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。
沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
离子交换层析纯化超氧化物歧化酶[原理]本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。
实验中选用DE-32离子交换纤维素。
相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。
[试剂和器材]1、试剂（1）DE-32（2）缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）（1）缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）2、器材（1）层析柱(2.5cm ×25cm)（2）部分收集器（2）梯度洗脱仪（3）紫外分光光度计（4）试管、透析袋[方法和步骤]1、DEAE-纤维素的预处理：（1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。
（2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。
如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。
（3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/LNaOH再处理一次。
（4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。
（5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。
用0.5mol/L盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。
（6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。
2、装柱（1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。
关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。
让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。
（2）将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液（约有1倍体积的缓冲液I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高10cm以上的柱床体积。
3、平衡当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。
流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。
（一般要平衡8h以上或过夜。
）4、层析用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液Ⅰ恰流到表面，关闭出口。
用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤2～3次，然后装入缓冲液Ⅰ，使液面高出创面2～3cm左右。
5、洗脱（1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。
（2）在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混合器）内各装入100mL缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。
（3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。
（4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在 1.5mL ／min。
收集液测定蛋白质浓度和酶活性。
（5）收集合并具有SOD活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）。
超氧化物歧化酶的活性测定SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2 -)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
[试剂和器材]1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器[方法和步骤]1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm 波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。
要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.020.0150 mmol/L邻苯三酚-0.012、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。