大蒜SOD的分离与提取
植物中SOD的分离提取及性质研究实验报告
反应，在 420nm 下测定吸光值。
2. 酶液的最适温度探究
试管
1号
2号
3号
4号
5号
试 剂 ml
温度处理（ ）
0
25
50
75
100
PH8.3 磷酸缓冲 液
3
3
3
3
3
SOD 酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
蒸馏水
2
2
2
2
2
在各自的温度下静置 10min,然后取出
邻苯三酚
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
向提取液中加入 0.25 倍体积的氯仿-乙醇混合液，搅拌 15min,5000r/min，离心 15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取 1ml 粗酶液备用，正确量取剩余粗酶液的体积，记录） SOD 的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,5000r/min, 离心 15min 得 SOD 沉淀。 将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/LPH 7.8 的磷酸缓冲液中，于 55~60° C 热处理 15min，再离心弃沉淀的得 SOD 酶液（留取 1ml 酶液备 用，正确量取剩余酶液的体积，记录）
2 / 16
加 2、不连续电泳
不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于 浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离 胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度） 的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续 电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的 选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得 到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技 术。
植物中SOD的分离提取及性质研究
植物中SOD的分离提取及性质研究前言：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。
SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。
在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。
植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。
材料及方法：一、试剂(1) PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液(2) PH8.2 50mmol/l Tris-HCL(3)0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液:准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。
4℃冰箱中保存可用1～2d。
(4)7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液:准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。
4℃冰箱中保存可用2～3d。
(5)含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液:A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
大蒜sod的提取分离和纯化
一、实习时间：２０１１.１２.２８二、实习地点：生科实验室４０８三．实验题目：大蒜中SOD 提取及分离纯化１.实验目的：（１）学习并掌握大蒜SOD 提取与纯化的方法及原理。
（２）学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD 酶活的方法。
（３）熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。
２.实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O 2-) 的歧化反应，使 O 2-转化为 H 2O 2 和 O 2。
因此，SOD 是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD 是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD 、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 3种。
Cu/Zn-SOD 是分布最广而且是最重要的SOD ，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD ，一般由两个亚基组成。
SOD 对热、pH 以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD 对氰化物及过氧化氢均敏感。
SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
Cu/Zn-SOD 由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm ，由于含铜，所以在可见光680nm 处有最大吸收。
国内测定SOD 活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。
在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O 2-）。
中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。
邻苯三酚的自氧化速率与O 2-的浓度有关。
当有SOD 存在时，由于它可催化超氧负离子(O 2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：222222O H O H O +=+-，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。
大蒜SOD的提取与分离
铜锌SOD的分离纯化与活性鉴定【实验导读】蛋白质的提取分离技术是化学生物学研究者应该熟练掌握的重点技术之一。
蛋白质的纯化步骤应根据纯化蛋白的具体性质来设计。
可以利用到的性质包括蛋白质的分子量大小、蛋白质的等电点、对有机溶剂的耐受性、对温度的耐受性、中性无机盐对蛋白质溶解性的影响等等。
为了保证蛋白质提取分离纯化的成功，需要在整个实验过程中，对所得蛋白质的总量和活性进行不断监测。
SOD是超氧化物歧化酶的简称，是一个典型的酶类蛋白质。
它催化超氧化物的歧化反应，是真核生物细胞内抗氧化酶系的重要组成部分。
它能够耐受相对较高的温度、对有机溶剂丙酮和氯仿-乙醇也具有较好的耐受性。
利用这些性质，本实验通过一些列实验流程达到了对大蒜SOD进行初步纯化的目的。
每经过一个纯化步骤，本实验都将监测所得产物的总蛋白量以及总SOD活性，并计算SOD酶在总蛋白中的比活力（总SOD活性与总蛋白量之比）。
如果分离纯化过程是成功的，则总蛋白量应不断下降，而SOD酶的比活力应不断上升。
通过本实验的训练，读者应该能够初步掌握蛋白质的纯化流程，根据所给蛋白质的理化性质设计出一套比较合理的蛋白质纯化方案。
一、实验目的1.进一步熟悉掌握分光光度计的使用方.2.熟悉SOD提取与分离的基本原理与操作方法，学习一般蛋白质纯化的基本流程.3.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的基本原理与操作.4.了解SOD活力测定—邻苯三酚法的原理.二、基本原理对于以氧气作为呼吸作用最终电子受体的生物来说，除将氧气还原为其完全还原产物水以外，还有可能产生包括超氧负离子(O2-)在内的一系列不完全还原产物，这类分子统称为活性氧族(reactive oxygen species, ROS)。
ROS具有极强的化学反应活性，可以与蛋白质、脂类、核酸等生物大分子发生反应并破坏它们的结构与生物学功能。
ROS在细胞内聚集将对细胞的正常生命活动造成不良后果。
为了应对这一潜在的严峻挑战，细胞内形成了一套有效的ROS清除系统。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离(生物分离纯化技术课件)
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
1
产品简介
2
实训目标
3பைடு நூலகம்
实训原理
4
实训试剂与设备
5
生产实训
6
产品检测
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品简介
一、产品简介 SOD是Super Oxide Dismutase 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是
生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微 生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。
lmmol/ L的EDT A 溶液，调pH为8.2。 三、检测器材
试管、吸管、容量瓶、量筒、电子分析天平、比色皿、722型分光光度计 。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离
产品检测 一、检测前准备 二、产品检测
1、检测装运、各种检测用试剂 2、检查检测记录等文件
1、样品 取样品10g(精 确 至0.001)。用水浸泡或溶解定 容至 100ml过滤，取滤液备用 。
SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证 实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细 胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。 由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大 量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
2、采用热变性法对粗酶液进行粗提：将大蒜中 SOD酶液于 60℃ 热处理 20min , 8 500r /min离心 10min ,弃沉淀, 取上清液。
大蒜细胞SOD酶的提取和分离 生产实训
3、采用丙酮沉淀法进行分离纯化：将酶液置于冰浴中,加入- 18℃ 预冷的丙酮，搅拌 10min，于 4500r/min离心 15min，弃上清液，用 50mmol /L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4℃ 过夜，4500 r/min离心 10min ，测定上清液的 SOD酶活力。
实验五大蒜SOD制备
实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。
组织捣碎机处理10min。
↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。
加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。
↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。
↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。
↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。
↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。
4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。
部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。
qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。
大蒜中SOD活性的测定
大蒜中SOD活性的测定一、实验目的：（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
（3）掌握离心机的使用。
二、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
三、实验试剂：大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根四、实验步骤：（1）SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）（3）SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1mL备用，其余量取体积。
（4）粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
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大蒜SOD的提取与分离
第三组：姚璇、姜银、刘梦琴、刘彩霞
一、实验目的
1.酶的提取与分离的基本原理和操作方法
二、实验原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
由于超氧自由基（O ）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O ，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。
三、实验器材
离心机、分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒、胶头滴管、电子天平、移液管
四、实验药品
新鲜蒜瓣
0.05mol/L磷酸缓冲液（pH=8.2）T
氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5
丙酮：用前需预冷至4-10℃
0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）
2mmol/L邻苯三酚
五、实验步骤
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管
pH=8.2碳酸缓冲液(Tris) 3.0 3.0 3.0
蒸馏水 2.0 1.8 1.7
样品液0 0 0.1
混合均匀静止室温20min
邻苯三酚0 0.2 0.2
加入邻苯三酚迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，在420nm测吸光值
实验结果
试管空白管对照管样品管
吸光值0 0.076 0.061
六、注意事项
1.酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。
2.肾上腺素邻苯三酚容易被氧化，故操作时要尽量快。