竹叶中黄酮提取分离及抗氧化活性研究

竹叶中黄酮提取分离及抗氧化活性研究摘要：采用体积分数95%的乙醇浸提与超声波相结合的方法提取竹叶黄酮，并通过邻苯三酚自氧化法和Fenton反应测定其抗氧化性能。

结果表明，竹叶黄酮的提取率为5.30%，粗提物中黄酮的含量为13.90%。

0.2 mL 1 mg/mL竹叶黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率为17.39%；0.7 mL 1 mg/mL竹叶黄酮对羟基自由基（·OH）的清除率为58.20%，表明竹叶黄酮有优良的抗氧化活性。

关键词：竹叶；总黄酮；提取；抗氧化Extraction of Flavonoids from Bamboo Leaves and Their Antioxidant ActivityAbstract：Total flavonoids were extracted from bamboo leaves by 95% ethanol as solvent and ultrasonic. The oxidation activity of flavonoids in bamboo leaf was determined by the methods of pyrogallol autoxidation and Fenton reaction. The results showed that the extraction yield of flavonoids from bamboo leaf was 5.30%，and the content of flavonoids in the crude extract was 13.90%. The clearance rate of O2-· by 0.2 mL 1 mg/mL bamboo leaf flavonoids was 17.39%；while the clearance rate of ·OH by 0.7 mL 1 mg/mL bamboo beaf flavonoids was 58.20%，it showed that flavonoids in bamboo leaf had good antioxidant activity.Key words：bamboo leaf；total flavonoids；extraction；antioxidant activity竹叶在中国有着悠久的食用和药用历史，其性淡、寒、味甘、微涩，具有清热利尿、明目解毒、止血、免疫调节、抗氧化、抗艾滋病和抑制肿瘤等功效，且无毒无害，可作为绿色食品进行开发。

竹叶中含有丰富的黄酮类物质，总黄酮含量平均在10 mg/g左右。

竹叶黄酮具有优良的抗溃疡、解痉、抗菌、消炎、降血脂、镇痛、利尿、降血清胆固醇和雌性激素、抗氧化等功效[1-7]。

郑德勇等[8]报道从竹叶中提取的总黄酮对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）具有显著的清除能力；张英等[9]和章荣华等[10]研究发现竹叶黄酮能显著提高衰老小鼠体内SOD和GSH-Px的活力，说明竹叶黄酮有优良和稳定的抗氧化活性。

闽北是中国竹子之乡，但目前对竹叶的利用十分有限，大部分被废弃，未能得到充分的利用。

本研究采用乙醇浸提和超声波提取相结合的方法从竹叶中提取总黄酮，并采用邻苯三酚自氧化法测定其清除超氧阴离子自由基（O2-·）的作用，用Fenton反应产生羟基自由基（·OH）使溴甲酚紫退色的方法测定竹叶黄酮清除羟基自由基的作用，为竹叶黄酮的开发利用提供参考。

1 材料与方法1.1 材料与仪器实验用竹叶采自福建省武夷山市，用蒸馏水洗净后80 ℃烘干，粉碎、过40目筛，烘干备用。

主要试剂包括芦丁标准品，购自国药集团；维生素C，生物级，购于Fluka 公司；溴甲酚紫、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、Tris-HCl、EDTA、邻苯三酚、乙醇、FeSO4·7H2O、过氧化氢、NaF、硫脲等均为市售分析纯。

主要仪器有721分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）、超声洗涤仪（深圳艾斯达超声波设备有限公司）、索氏脂肪提取器（上海创萌生物技术有限公司）等。

1.2 竹叶黄酮的提取称取50.0 g竹叶粉末，置于索氏脂肪提取器中，用石油醚去除脂肪、色素至无色为止。

竹叶粉末挥发除去石油醚后加入体积分数95%的乙醇450 mL，室温浸提4 h，期间振摇数次，再在60 ℃、超声波功率75 W的条件下提取5 min，过滤。

残渣同法再提取1次，合并两次提取液，水浴减压回收乙醇，浓缩至20 mL 左右时移入提前称好重量的培养皿，80 ℃下烘干乙醇得黄酮粗品，称重，计算提取率。

1.3 竹叶黄酮含量测定1.3.1 芦丁标准曲线的绘制[11] 分别取0.2 mg/mL芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于8只25 mL容量瓶中，加入50 g/L的NaNO2 1.0 mL，摇匀，放置6 min后加入100 g/L的Al（NO3）3 1.0 mL，6 min后再加入40 g/L的NaOH溶液10.0 mL，混匀，用水稀释至刻度，15 min后以第一管为空白参比，采用比色法在510 nm波长下测吸光度。

以吸光度A510 nm为纵坐标、芦丁浓度C为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2 竹叶黄酮含量测定准确称取黄酮粗品100.0 mg，加入体积分数80%的乙醇溶液，摇匀，定容至100 mL，得到样品液。

精确吸取1.0 mL样品液于25 mL容量瓶中，加入50 g/L的NaNO2 1.0 mL，摇匀，放置6 min后加入100 g/L的Al（NO3）3 1.0 mL，6 min后再加入40 g/L 的NaOH溶液10.0 mL，混匀，用水稀释至刻度，摇匀放置15 min后以试剂空白作参比测定A510 nm。

由回归方程求出稀溶液中总黄酮的浓度，计算提取物中黄酮的含量。

1.4 竹叶黄酮抗氧化活性的测定1.4.1 竹叶黄酮对O2-·的清除作用[12] ①邻苯三酚自氧化速率的测定。

在2支试管中各加9 mL Tris-HCl-EDTA缓冲液，对照管加40 μL蒸馏水，混匀，以1 cm比色皿、420 nm调吸光度为零，测定管加40 μL邻苯三酚，混匀后立即加入1 cm比色皿，每分钟读取420 nm处的吸光度A0，重复3次，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制邻苯三酚自氧化曲线。

②竹叶黄酮对O2-·清除率的测定。

在上述体系中分别加入0.1、0.2、0.3 mL 1 mg/mL竹叶黄酮，测定10 min时420 nm处的吸光度As。

O2-·的清除率I=■×100%1.4.2 竹叶黄酮对·OH的清除作用[13] ①溴甲酚紫-盐酸-Fe2+溶液空白实验。

于10 mL比色管中分别加入0.4 mL溴甲酚紫溶液、0.5 mL 0.1 mol/L盐酸、1.0 mL 1 mmol/L硫酸铁溶液、0.5 mL 0.1 mol/L过氧化氢溶液，用水稀释到刻度，摇匀。

置于30 ℃恒温水浴中反应8 min，取出后迅速加入0.2 mL 0.05 mol/L NaF 溶液混匀终止反应。

用1 cm比色皿、以水为参比，测定溶液在420 nm处的吸光度A，同法测定溴甲酚紫-盐酸溶液空白试液的吸光度A0，计算吸光度变化值△A=A0-A。

②硫脲和竹叶黄酮对·OH清除率的测定。

在上述体系中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 1 mg/mL硫脲和竹叶黄酮，测定体系在420 nm处的吸光度As。

·OH的清除率D=■×100%2 结果与分析2.1 芦丁标准曲线与回归方程芦丁浓度与吸光度A510 nm的关系曲线见图1，对实验数据进行二阶线性回归，得芦丁浓度C对A510 nm的回归方程A510 nm=0.407 9C+0.013 2，相关系数r=0.999 6。

说明在8～48 mg/L范围内芦丁浓度与吸光度A510 nm具有良好的线性关系。

2.2 竹叶黄酮的提取率和含量以体积分数95%的乙醇溶液浸提结合超声波法提取竹叶黄酮，从50.0 g竹叶粉末中提取得到的竹叶总黄酮粗品质量为2.650 5 g，提取率为5.30%；根据测定的总黄酮浓度及芦丁标准曲线回归方程计算得到提取物中竹叶黄酮的含量为13.90%。

2.3 竹叶黄酮抗氧化性能的测定2.3.1 竹叶黄酮对O2-·的清除作用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，并同时释放出O2-·，O2-·又加速邻苯三酚自氧化速率，同时产生有色中间产物，中间产物在420 nm处有强烈的吸收，通过测定吸光度A420 nm可以测定邻苯三酚的自氧化速率。

在该反应体系中加入氧自由基清除剂时邻苯三酚自氧化受阻，故可通过抑制邻苯三酚自氧化的方法测定抗氧化剂体外清除O2-·的性能。

在一定时间内邻苯三酚自氧化产生有色中间产物的积累与时间呈良好的线性关系[14-16]。

本实验中邻苯三酚自氧化在10 min内A420 nm和时间之间呈现良好的线性关系（图2），回归方程为Y=0.017 0X-0.006 5，r=0.998 8，10 min后A420 nm的增加显著减慢，逐渐失去线性关系。

因此本实验通过测定反应10 min时A420 nm的变化来测定竹叶黄酮对O2-·的清除率，结果见图3。

由图3可以看出，竹叶黄酮的剂量由0.1 mL增加到0.2 mL时，O2-·的清除率由10.35%升高到17.39%，而后继续增加剂量，清除率并没有发生太大的变化。

2.3.2 竹叶黄酮对·OH的清除作用通过抑制Fenton反应产生·OH使溴甲酚紫退色法测定硫脲和竹叶黄酮清除·OH的作用，图4为不同剂量硫脲和竹叶黄酮对·OH的清除率。

由图4可知，0.1 mg/mL硫脲的剂量从0.1 mL增加到0.6 mL，其对·OH的清除率升高；剂量为0.6 mL时清除率最高，为70.90%；继续加大剂量清除率不再升高，这与张德莉等[17]的结果一致。

1 mg/mL的竹叶黄酮用量从0.1 mL增加到0.7 mL时，其对·OH清除率从10.41%升高到58.20%，而后进一步增大竹叶黄酮的含量，清除率反而略有降低。

3 小结与讨论本研究采用乙醇浸提和超声波相结合的方法提取竹叶黄酮，得到竹叶黄酮的提取率为5.30%，粗提物中黄酮的含量为13.90%。

通过其抑制邻苯三酚自氧化和Fenton反应测定竹叶黄酮的抗氧化活性，结果显示竹叶黄酮具有良好的抗氧化性能。