第4章优良菌种选育
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第4章菌种选育.ppt.Convertor第四章菌种选育1菌种选育应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。
菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。
菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。
2自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种（详后）3一、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。
自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。
一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）4自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高5制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：6自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。
自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。
二、诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。
目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。
以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为40U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。
237.3优良菌种的选育生物技术制药
➢ 化学诱变剂 碱基类似物、吖啶类、烷化剂
➢ 生物诱变剂 噬菌体、转座子
菌种选育的方法——杂交育种
杂交育种一般指利用真核微生物 的有性生殖或准性生殖，或原核微生 物的接合、转化和转导等过程，促使 两个具有不同遗传性状的菌株进行遗 传物质交换和基因重组，以获得优良 性能或新的品种的生产菌株。
杂交育种是一个重要的微生物育 种手段。比起诱变育种，它具有更强 的方向性或目的性。
微生物代谢控制育种是指以生物化学和 遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途 径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线， 通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物 正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有 用产物选择性地大量合成积累。
菌种选育的方法——基因工程育种
基因工程育种技术是一种DNA 体外重组技术，是将人工方法获得的 一段外源DNA分子，用某一限制性内 切酶切割后，与载体DNA连接，然后 导入到某一受体细胞中进行复制、转 录和翻译，从而使受体细胞表达出外 源基因所编码的遗传性状的一种技术。
2.菌种选育
菌种选育是运用遗传学原理和技术
对某种具有特定生产目的的菌株进 行改造，去除不良性质，增加有益 新性状，以提高产品的产量和质量 的一种育种方法，使我们获得所需 要的高产、优质和低耗的菌种。
菌种选育的方法
菌种选育的方法
➢经验育种方法： 自然选育、诱变育种、杂交育种
➢定向育种方法： 代谢控制育种、原生质体融合、
基因重组
菌种选育的方法——自然选育
利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理， 通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高
于原有生产水平菌株的过程称为自然选育。
缺点：效率低、进展慢 自然突变频率:10-6-10-10
微生物的天然进化不可能刻意去照顾人类的利益源自自然选育操作步骤： 生产菌种
➢ 生物诱变剂 噬菌体、转座子
菌种选育的方法——杂交育种
杂交育种一般指利用真核微生物 的有性生殖或准性生殖，或原核微生 物的接合、转化和转导等过程，促使 两个具有不同遗传性状的菌株进行遗 传物质交换和基因重组，以获得优良 性能或新的品种的生产菌株。
杂交育种是一个重要的微生物育 种手段。比起诱变育种，它具有更强 的方向性或目的性。
微生物代谢控制育种是指以生物化学和 遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途 径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线， 通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物 正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有 用产物选择性地大量合成积累。
菌种选育的方法——基因工程育种
基因工程育种技术是一种DNA 体外重组技术，是将人工方法获得的 一段外源DNA分子，用某一限制性内 切酶切割后，与载体DNA连接，然后 导入到某一受体细胞中进行复制、转 录和翻译，从而使受体细胞表达出外 源基因所编码的遗传性状的一种技术。
2.菌种选育
菌种选育是运用遗传学原理和技术
对某种具有特定生产目的的菌株进 行改造，去除不良性质，增加有益 新性状，以提高产品的产量和质量 的一种育种方法，使我们获得所需 要的高产、优质和低耗的菌种。
菌种选育的方法
菌种选育的方法
➢经验育种方法： 自然选育、诱变育种、杂交育种
➢定向育种方法： 代谢控制育种、原生质体融合、
基因重组
菌种选育的方法——自然选育
利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理， 通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高
于原有生产水平菌株的过程称为自然选育。
缺点：效率低、进展慢 自然突变频率:10-6-10-10
微生物的天然进化不可能刻意去照顾人类的利益源自自然选育操作步骤： 生产菌种
优良菌珠的选育
五、诱变育种的具体方法
（一）菌悬液的制备，单核，单细胞（孢子10 6 个/mL）
1.菌悬液用生理盐水（ 物理因素处理 ）或缓冲液配
制（化学因素处理中pH不同诱变效果不同或pH
比较长） 容易改变、处理时间
2.用灭菌的玻璃珠把成团的细胞打碎 3.用灭菌的脱脂棉球进行过滤。
（二）诱变处理 根据诱变剂及诱变对象的特点选 用适当处理参数 。
第四章 优良菌株选育与提纯复壮
本章的重点是诱变育种及杂交育
种中几个值得注意的具有普遍意义的 基本问题，以及菌株提纯复壮技术。
内容提要
一、优良菌株的选育
二、优良菌株提纯复壮
第一节
优良菌株的选育
一、食用菌育种常规步骤
二、食用菌育种目标 三、食用菌选择育种 四、食用菌诱变育种
五、食用菌杂交育种
一、食用菌育种常规步骤
地控制生物的生殖，而不是随机进行，以不断累积和有
效利用自然发生的有益变异，进而保留适合人类需要的
个体，培育新品种的过程。
二、人工选择育种应注意的几个基本问题
（1）选择必须针对可遗传的变异
（2）侧重于在不同菌株之间进行选择 （3）必须广泛收集不同地域、不同生态型、
不同栽培特点的菌株
黑木耳耳片大小、厚薄和耳脉
在一定范围内，双亲间的亲缘关系、生
态类型和生理特性上差异越大的，双亲间的相
C、亚硝酸：通过强氧化作用，以氧代替腺嘌呤，
胞嘧啶C6位置上的氨基。
（3）空间诱变等因素
高空环境具有高真空、微重力和多种高能粒
子辐射等特点，具有诱变育种的多种因子。这种特
殊的物理化学环境，引起菌种DNA分子的变异和重
组，从而得到生产效价更优异的高产菌种。 我国空间诱变育种的搭载方式主要有两种，一 种是返地式卫星搭载、另一种是高空气球，高空气 球的条件一般为30～40km ，停留时间在10h 左右。
第四章 菌种的选育和保存
3、采用单核细胞处理
诱变剂所处理的细胞中的细胞核愈少愈好，最好 是处理单核细胞（用玻璃珠打散）。如处理霉菌 或放线菌，则尽量采用孢子进行处理。如是芽孢 杆菌，则处理芽孢。
4、注意微生物的生理状态
一般对数期的细菌对诱变最为敏感。让霉菌或放 线菌的分生孢子稍稍萌发，可以提高诱变效果。
5、适宜的诱变方法
2). 嵌合剂
常用有哑啶类染料、溴乙锭、ICR等化合物。能 引起移码突变。
3). 碱基类似物
分子结构与DNA上的碱基相似的化合物称为碱基 类似物。如5-溴尿嘧啶（5-BU）、6-氨基嘌呤等 。这些化合物干扰了DNA分子内酮式与烯醇式的 平衡。它们掺入DNA分子，使其出现烯醇的比例 增加。分别形成AT向GC和GC向AT的转换。
2、引入抗性基因和调节基因，增加抗生素单位 产量
许多抗生素生物合成基因经常与菌种对自身抗生 素耐药基因连锁存在，因此可利用高拷贝质粒的 基因剂量，提高菌种对自身抗生素的抗性，可提 高抗生素产量。
另外，调节基因在抗生素的生物合成中也起很重 要的作用，增加正调节基因的拷贝数也能大幅度 地提高次级代谢物的合成能力。
可将Vgb通过质粒转入变青链霉菌和天蓝色链霉 菌中,在限氧条件下不仅使菌体生长量增加,还使 其放线紫红素产量提高。也可将Vgb引入产黄顶 头孢霉菌及产黄青霉菌中,限氧时VHb在前者的 表达量较高,而且头孢菌素C的产量比对照菌株提 高5倍。 但这些实验仅在“限氧”这个特定条件下进行， 而在工业发酵上，它的表达量很低，没有显示出 产量增加优势，还有待进一步深入研究。
特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处 理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异 的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的 几率。
物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中 子、β射线、超声波、激光
《优良菌种的选育》课件
通过观察菌落的形状、大小、颜色等特征，以及 显微镜下观察菌体形态、染色反应等，对菌种进 行初步鉴定。
生理生化鉴定
通过测定菌种的生理生化指标，如糖发酵试验、 氧化酶试验、氨基酸脱羧酶试验等，对菌种进行 进一步的分类和鉴定。
分子生物学鉴定
利用基因测序、PCR扩增、DNA指纹图谱等技术 ，对菌种的基因组进行分析，从而准确鉴定菌种 的种属和分类地位。
测定菌种在不同环境压力下的存活率 、耐受性等，了解菌种的抗逆性能和 适应性。
05 优良菌种的应用与案例分析
优良菌种在工业生产中的应用
01
02
03
生物能源
利用优良菌种将有机废弃 物转化为生物燃料，如乙 醇、生物柴油等，降低对 化石燃料的依赖。
生物化工
通过优良菌种生产高附加 值的化学品、材料和生物 聚合物，如柠檬酸、聚乳 酸等。
《优良菌种的选育》 ppt课件
目录
Contents
• 优良菌种选育的重要性 • 优良菌种的选育方法 • 优良菌种的保藏与复壮 • 优良菌种的鉴定与评价 • 优良菌种的应用与案例分析
01 优良菌种选育的重要性
菌种选育对生产效率的影响
菌种选育能够提高生产效率
通过选育具有优良性状的菌种，可以缩短发酵周期，提高产物的合成速度，从 而提高生产效率。
生物冶金
利用微生物从矿石中提取 有价值的金属，如铜、钴 等，具有环保和资源可持 续性的优势。
优良菌种在农业生产中的应用
生物肥料
01
通过微生物肥料提高土壤肥力和植物生长，减少化肥使用，降
低环境污染。
生物农药
02
利用有益微生物防治植物病虫害，减少化学农药的使用，保障
食品安全。
生物饲料
生理生化鉴定
通过测定菌种的生理生化指标，如糖发酵试验、 氧化酶试验、氨基酸脱羧酶试验等，对菌种进行 进一步的分类和鉴定。
分子生物学鉴定
利用基因测序、PCR扩增、DNA指纹图谱等技术 ，对菌种的基因组进行分析，从而准确鉴定菌种 的种属和分类地位。
测定菌种在不同环境压力下的存活率 、耐受性等，了解菌种的抗逆性能和 适应性。
05 优良菌种的应用与案例分析
优良菌种在工业生产中的应用
01
02
03
生物能源
利用优良菌种将有机废弃 物转化为生物燃料，如乙 醇、生物柴油等，降低对 化石燃料的依赖。
生物化工
通过优良菌种生产高附加 值的化学品、材料和生物 聚合物，如柠檬酸、聚乳 酸等。
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目录
Contents
• 优良菌种选育的重要性 • 优良菌种的选育方法 • 优良菌种的保藏与复壮 • 优良菌种的鉴定与评价 • 优良菌种的应用与案例分析
01 优良菌种选育的重要性
菌种选育对生产效率的影响
菌种选育能够提高生产效率
通过选育具有优良性状的菌种，可以缩短发酵周期，提高产物的合成速度，从 而提高生产效率。
生物冶金
利用微生物从矿石中提取 有价值的金属，如铜、钴 等，具有环保和资源可持 续性的优势。
优良菌种在农业生产中的应用
生物肥料
01
通过微生物肥料提高土壤肥力和植物生长，减少化肥使用，降
低环境污染。
生物农药
02
利用有益微生物防治植物病虫害，减少化学农药的使用，保障
食品安全。
生物饲料
三、 优良菌种选育,四菌种保藏的原理和方法
◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法
温度敏感突变型筛选
TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant）
指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。
高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。 温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种
解除反馈阻遏
解除反馈抑制
通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过 抗结构类似物突变的方法筛选出来的 ◆ 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构 酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用； 但不能代替末端产物参与生物合成 ◆ 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可 合成末端产物
末端产物
许可温度(permissive temperature)
保持原来正常性状的温度
限制性温度(restrictive temperature〉 非许可温度 (non-permissive temperature)
显现突变型性状的温度
TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区 别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不 同。
1
自然选育
• 不经人工处理．利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为 自然选育（spontaneous mutation）：选育、定向培育 • 自然突变：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应 • 多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在着低剂量的宇宙 射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。 • 互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构， 会引起碱基的错配。引起自然突变的几率为10-8-10-9 • 自然突变的结果：一种是菌种退化；一种是对生产有益的突变
食品微生物学 第四章微生物遗传与菌种选育 第二节微生物的菌种选育
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.1 诱变育种的步骤:
确定出发菌 ↓
菌种的纯化选优 ↓出发菌株性能测定
同步培养 ↓
制备单细胞（单孢子）悬液 ↓
诱变剂选择与诱变剂量的预试验 ↓
诱变处理 ↓
平板分离 ↓计形态变异菌落数、↓
重复筛选 ↓摇瓶发酵试验
选出突变株进行生产试验
如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求， 可以留之作为菌种选育的出发菌株。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2 微生物的诱变育种
诱变育种是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群， 促进其突变率在同提高，再从中筛选出少数符合育种目的的 突变株。
诱变育种的主要手段是以合适的诱变剂处理大量而分散 的微生物细胞，在引起大部分细胞死亡的同时，使存活细胞 的突变率迅速提高，再设计既简便、快速又高效的筛选方法， 进而淘汰负突变并把正突变中效果最好的优良菌株挑选出来。
微生物遗传与菌种选育
4.2.1.4 纯种培养 经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落
形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定， 对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。 4.2.1.5 生产性能测定
从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛 选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作 为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.2 营养缺陷型突变株的筛选
在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有 着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的 缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱 基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养 物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野 生菌株。
《发酵工程》理论课教学大纲(供四年制本科生物工程专业使用)
《发酵工程》理论教学大纲(供四年制本科生物工程专业使用)I 前言发酵工程是生物学各专业本科生的专业课。
通过学习在工、农、医等方面的应用及发酵工艺的控制、发酵产物的提取、生产设备的结构，了解该学科的发展前沿、热点和问题，使学生牢固掌握发酵工程的基本理论和基础知识，为学生今后的学习及工作实践打下宽厚的基础。
本大纲适用于四年制本科生物工程专业使用。
现将大纲使用中有关问题说明如下：一为了使教师和学生更好地掌握教材，大纲每一章节均由教学目的、教学要求和教学内容三部分组成。
教学目的注明教学目标，教学要求分掌握、熟悉和了解三个级别，教学内容与教学要求级别对应，并统一标示（核心内容即知识点以下划实线，重点内容以下划虚线，一般内容不标示）便于学生重点学习。
二教师在保证大纲核心内容的前提下，可根据不同教学手段，讲授重点内容和介绍一般内容。
三总教学参考学时数：40学时，其中理论课36学时，实验课（参观）4学时。
理论与实验学时之比为9:1。
四教材：《微生物工程》，科学出版社出版，曹军卫主编，第二版，2007年3月。
Ⅱ正文第1章微生物工程概论一教学目的学习微生物工程的发展简史及其应用，发酵的一般过程。
二教学要求（一）了解微生物工程的发展简史。
（二）熟悉微生物工程的应用。
（三）掌握发酵的一般过程三教学内容（一）微生物工程的发展简史。
（二）微生物工程的应用（三）发酵的一般过程第2章生产菌种的来源一教学目的学习生产菌种的来源、分离方法。
二教学要求（一）掌握生产菌种的分离方法。
（二）掌握抗生素产生菌的分离。
（三）掌握氨基酸产生菌的分离。
三教学内容（一）生物物质产生菌的筛选过程。
（二）菌种的分离。
第3章微生物的代谢调节与代谢工程一教学目的通过本章的学习，学习初级代谢与次级代谢的概念、特点及二者的关系；微生物代谢的类型及关系；微生物代谢自我调节的方法及代谢调控方法；代谢工程的定义及方法。
二教学要求（一）了解微生物的代谢类型及关系。
（二）掌握初级代谢与次级代谢的概念、特点及二者的关系。
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但是自然选育的效率低，因此经常与 诱变选育交替使用，以提高效率。
4.2 诱变选育
微生物其自身代谢过程是被严格调控的， 所有的代谢产物都不会过量积累，并且还 存在着代谢产物的分解途径。
因此从自然环境中分离的菌种的生产能 力有限，一般不能满足生产的实际需要。
诱变育种是提高菌种生产能力，使所需 要的某一特定的代谢产物过量积累的有效 方法之一。
4.2.1 诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变，突变 主要包括染色体畸变和基因突变两大类。
诱变育种:就是利用各种物理化学诱变剂 处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌 种。
常用的诱变剂包括物理、化学和生物的 三大类，见P35 表4-1。
4.2.2 诱变育种的基本方法
4.2.3 突变菌株的筛选
诱变处理后，正向突变的菌株通常为少 数，需进行大量的筛选，才能获得高产菌 株。
通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件 的优化研究，确定最佳的发酵条件，才能 使高产菌株的生产能力充分发挥出来。
经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各 样的变异，如营养变异、抗性变异、代谢变 异、形态变异、生长繁殖变异、发酵温度变 异等。
这些技术都为生产提供了优良生产性能的菌种， 本章将对此作一些简要的介绍。
选育优良菌种常用的方法：
自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术。
优良菌种的衡量标准: 一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的
基本特性：① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨（见教 材P33）。
若此酶是某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的 酶，该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型。
（4）敏感突变
柠檬酸经顺乌头酸酶催化，转化为异柠檬酸。 生产上为了提高柠檬酸的产量，必须抑制顺乌头酸酶 活性，防止异柠檬酸的产生。 氟乙酸可抑制顺乌头酸酶活性，通过诱变处理造成顺 乌头酸酶结构基因的突变，有可能造成酶活力下降，那 么此菌株必然对氟乙酸更加敏感，即不足于抑制野生菌 顺乌头酸酶活力的某一氟乙酸浓度，会对突变型产生抑 制作用。
通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是 通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。
结构类似物与末端产物有相似的结构，能 与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物 参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此它 们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的。未 突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而 死亡。抗反馈调节突变菌株则即使在结构类似 物存在下，仍可合成末端产物形成菌落。
如链霉菌基因重组过程如下：
亲本Ⅰ 亲本Ⅱ
混合菌丝
异核体 部分合子
亲本分离子
异核系
重组体
4.3.2.2 放线菌的杂交方法
放线菌的杂交包括混合培养法（图4-2） 、 平板杂交法和玻璃纸转移法三种。
4.3.3 霉菌的杂交育种
在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
发现准性生殖之后，才证明微生物除了进 行普遍无性繁殖外，还存在着准性生殖过 程。这为这类微生物的遗传学研究和杂交 育种提供了一条有效的方法。
诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
诱变部分成功的关键包括: (1) 出发菌株的选择 (2) 诱变剂种类和剂量的选择 (3) 合理的使用方法
4.2.2.1 出发菌种的选择
用来进行诱变的出发菌种的性能对提高诱变效 果和效率十分重要。应注意下列方面： （1）选择出发菌种应注意诱变出发菌种要有一
定的目标产物的生产能力。 （2）其他生产性能如生长繁殖快、营养要求低、
噬菌体感染的筛选过程也可以反复多次， 使敏感菌株裂解，从中筛选出抗性菌株。
（3）条件抗性突变
条件抗性突变也称为条件致死突变，其中温度 敏感突变常可提高产物的产量。
如适于在中温条件下（如37℃）生长的细菌， 经诱变后获得的温度敏感突变，只能在低于37℃ 的温度下生长。
这主要是因某一酶蛋白结构改变后，在高温条 件下丧失了活力。
自然选育的一般程序是将菌种制成菌 悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落， 再分别测定单菌落的生产能力，从中选出 高水平菌种。
※自然突变可能会产生两种截然不同的 结果,一种是菌种退化而导致目标产物产量 或质量下降;另一种是对生产有益的突。
自然选育是一种简单易性的选育方法， 可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定 生产、提高产量的目的。
4.1自然选育
自然选育:不经人工处理，利用微生物的自 然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多 因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应:是指在自然环境 中存在着低剂量的宇宙射线，各种短波辐射， 低剂量的诱变物质，和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。
在直链式的氨基酸、核苷酸合成中，营养缺陷型 突变株只能积累中间产物，而不能积累终产物。
在分枝代谢途径中，筛选的营养缺陷型突变菌株 是通过解除协同反馈调节，可使另一分枝代谢途径 中的末端产物积累。
遗传障碍不完全突变即渗漏型，是一种酶活性下 降的突变，不是完全丧失酶活性，因它不会过量积 累末端产物，可避免反馈调节，大量积累中间产物， 这种突变菌株在不添加相应物质的基本培养基上长 成很小的菌落。
其杂交技术包括以下步骤：
（1）异核体形成 （2）双倍体的检出 （3）分离子的检出
4.3.4 酵母的杂交育种
酵母菌是双单性微生物，存在着单倍体 和二倍体的生活史，具有孟德尔式的分离 现象，以及a和α交配型。可以利用酵母菌 的双单特性进行杂交育种。
酵母菌的二倍体的生活力较单倍体要强， 生产能力如发酵性能、产酒率等也明显高 于单倍体，因此通过杂交得到二倍体，就 有可能达到育种的目的。
一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增 加而提高，但达到一定程度以后，再提高 剂量反使诱变率下降。因此近年来已将处 理剂量从过去的致死率99～99.9%降至70～ 80%，甚至更低。
但诱变剂剂量也不宜过高。高剂量诱变 可导致细胞核发生变异，也可使其他的核 破坏死亡，形成较纯的变异菌落。
并且高剂量会引起难以恢复突变的巨大 损伤，促使变异菌株稳定，不易产生恢复 突变。
（2）抗噬菌体菌株的选育
噬菌体的感染常给工业生产造成巨大的损失。 而且噬菌体很容易发生变异，使对噬菌体原具 有抗性的菌株失去抗性，所以需要不断选育抗性 菌株。 有研究表明，细菌对噬菌体的抗性是基因突变 的结果，这种抗性可以发生在接触噬菌体以前， 与噬菌体的存在与否无关。
抗噬菌体菌株的筛选可采用自然突变和 诱发突变两种方法。
§4 菌种选育
尽管生产菌种最初均是来自于自然界,但天然 菌种的生产性能一般比较低下。优良菌种的选育为 生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种 产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品 质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。
特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为 定向技术的发展，使菌种选育技术不断更新，而产生 出众多有价值的微生物工程产品。主要的育种技术包 括： –自然选育 –诱变选育 –抗噬菌体菌种的选育 –杂交育种 –原生质体融合技术 –基因工程技术等
※在这些基因重组的过程中，并不涉及 整个染色体组，所形成的都是部分合子。
在细菌接合中，将带有两个以上不同选择性遗 传标记的两个菌株进行杂交。
细菌的其他方式杂交，如F因子转导、R因子转 移、转化和转导等，都需要出发菌株带有选择性 遗传标记，使杂交菌落容易识别，方便快速筛选。 如：营养缺陷、抗生素抗性、温度敏感、发酵性 能等。
产孢子多且早、对诱变剂敏感。 （3）用作诱变的出发菌种还必须了解它的产量、
形态、生理等方面的情况。 （4）可选择已经过诱变处理的菌种，因为这样
的菌种对诱变剂的敏感性会有所提高。
4.2.2.2 诱变剂的使用方法
在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱变 剂处理和复合诱变剂处理。
复合诱变剂处理：是指用两种以上的诱变方法 处理菌种。
这些变异的菌种可用各种方法筛选出来。
4.2.3.1 营养缺陷型突变菌株的筛选
营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理 论研究和工业应用意义，已广泛地在氨基酸、核 苷酸生产中获得应用。
在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端 产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克 服生长障碍，就能使中间产物积累。
4.3.2 放线菌的杂交
• 放线菌与细菌一样都是原核生物，只有一 条环状染色体。
• 但却象霉菌那样以菌丝形态生长，并形成 分生孢子。
• 其基因重组过程近似于细菌，但它们的育 种方法有许多与霉菌相似。
4.3.2.1放线菌的遗传体系和杂交原理
放线菌基本上有以下四种遗传体系：
（1）异核现象 （2）接合现象 （3）异核系的形成 （4）重组体的形成
4.2.3.2 抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变菌株的筛选
末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍 存在的，除了采用筛选营养缺陷型突变菌株，来降 低末端产物的浓度外，更加有效的办法是筛选抗阻 遏和抗反馈抑制突变株。
这两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的 表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时，仍 不断合成这一产物。但其代谢失调的原因不同。
通过杂交还可以：
（1）扩大变异范围； （2）改变产品的产量和质量； （3）甚至创造出新品种。
由于多数微生物尚未发现有性世代，因 此直接亲本菌株应具有适当的遗传标记， 如颜色、营养要求（即营养缺陷标记）、 或抗药性等。
4.3.1 细菌的杂交
细菌的杂交可以通过：
（1）细菌接合 （2）F因子转导 （3）R因子转移 （4）转化和转导等方法促使基因重组
4.3 杂交育种
生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生 活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、 代谢减慢、产量增加缓慢。
4.2 诱变选育
微生物其自身代谢过程是被严格调控的， 所有的代谢产物都不会过量积累，并且还 存在着代谢产物的分解途径。
因此从自然环境中分离的菌种的生产能 力有限，一般不能满足生产的实际需要。
诱变育种是提高菌种生产能力，使所需 要的某一特定的代谢产物过量积累的有效 方法之一。
4.2.1 诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变，突变 主要包括染色体畸变和基因突变两大类。
诱变育种:就是利用各种物理化学诱变剂 处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌 种。
常用的诱变剂包括物理、化学和生物的 三大类，见P35 表4-1。
4.2.2 诱变育种的基本方法
4.2.3 突变菌株的筛选
诱变处理后，正向突变的菌株通常为少 数，需进行大量的筛选，才能获得高产菌 株。
通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件 的优化研究，确定最佳的发酵条件，才能 使高产菌株的生产能力充分发挥出来。
经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各 样的变异，如营养变异、抗性变异、代谢变 异、形态变异、生长繁殖变异、发酵温度变 异等。
这些技术都为生产提供了优良生产性能的菌种， 本章将对此作一些简要的介绍。
选育优良菌种常用的方法：
自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术。
优良菌种的衡量标准: 一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的
基本特性：① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨（见教 材P33）。
若此酶是某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的 酶，该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型。
（4）敏感突变
柠檬酸经顺乌头酸酶催化，转化为异柠檬酸。 生产上为了提高柠檬酸的产量，必须抑制顺乌头酸酶 活性，防止异柠檬酸的产生。 氟乙酸可抑制顺乌头酸酶活性，通过诱变处理造成顺 乌头酸酶结构基因的突变，有可能造成酶活力下降，那 么此菌株必然对氟乙酸更加敏感，即不足于抑制野生菌 顺乌头酸酶活力的某一氟乙酸浓度，会对突变型产生抑 制作用。
通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是 通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。
结构类似物与末端产物有相似的结构，能 与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物 参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此它 们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的。未 突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而 死亡。抗反馈调节突变菌株则即使在结构类似 物存在下，仍可合成末端产物形成菌落。
如链霉菌基因重组过程如下：
亲本Ⅰ 亲本Ⅱ
混合菌丝
异核体 部分合子
亲本分离子
异核系
重组体
4.3.2.2 放线菌的杂交方法
放线菌的杂交包括混合培养法（图4-2） 、 平板杂交法和玻璃纸转移法三种。
4.3.3 霉菌的杂交育种
在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
发现准性生殖之后，才证明微生物除了进 行普遍无性繁殖外，还存在着准性生殖过 程。这为这类微生物的遗传学研究和杂交 育种提供了一条有效的方法。
诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
诱变部分成功的关键包括: (1) 出发菌株的选择 (2) 诱变剂种类和剂量的选择 (3) 合理的使用方法
4.2.2.1 出发菌种的选择
用来进行诱变的出发菌种的性能对提高诱变效 果和效率十分重要。应注意下列方面： （1）选择出发菌种应注意诱变出发菌种要有一
定的目标产物的生产能力。 （2）其他生产性能如生长繁殖快、营养要求低、
噬菌体感染的筛选过程也可以反复多次， 使敏感菌株裂解，从中筛选出抗性菌株。
（3）条件抗性突变
条件抗性突变也称为条件致死突变，其中温度 敏感突变常可提高产物的产量。
如适于在中温条件下（如37℃）生长的细菌， 经诱变后获得的温度敏感突变，只能在低于37℃ 的温度下生长。
这主要是因某一酶蛋白结构改变后，在高温条 件下丧失了活力。
自然选育的一般程序是将菌种制成菌 悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落， 再分别测定单菌落的生产能力，从中选出 高水平菌种。
※自然突变可能会产生两种截然不同的 结果,一种是菌种退化而导致目标产物产量 或质量下降;另一种是对生产有益的突。
自然选育是一种简单易性的选育方法， 可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定 生产、提高产量的目的。
4.1自然选育
自然选育:不经人工处理，利用微生物的自 然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多 因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应:是指在自然环境 中存在着低剂量的宇宙射线，各种短波辐射， 低剂量的诱变物质，和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。
在直链式的氨基酸、核苷酸合成中，营养缺陷型 突变株只能积累中间产物，而不能积累终产物。
在分枝代谢途径中，筛选的营养缺陷型突变菌株 是通过解除协同反馈调节，可使另一分枝代谢途径 中的末端产物积累。
遗传障碍不完全突变即渗漏型，是一种酶活性下 降的突变，不是完全丧失酶活性，因它不会过量积 累末端产物，可避免反馈调节，大量积累中间产物， 这种突变菌株在不添加相应物质的基本培养基上长 成很小的菌落。
其杂交技术包括以下步骤：
（1）异核体形成 （2）双倍体的检出 （3）分离子的检出
4.3.4 酵母的杂交育种
酵母菌是双单性微生物，存在着单倍体 和二倍体的生活史，具有孟德尔式的分离 现象，以及a和α交配型。可以利用酵母菌 的双单特性进行杂交育种。
酵母菌的二倍体的生活力较单倍体要强， 生产能力如发酵性能、产酒率等也明显高 于单倍体，因此通过杂交得到二倍体，就 有可能达到育种的目的。
一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增 加而提高，但达到一定程度以后，再提高 剂量反使诱变率下降。因此近年来已将处 理剂量从过去的致死率99～99.9%降至70～ 80%，甚至更低。
但诱变剂剂量也不宜过高。高剂量诱变 可导致细胞核发生变异，也可使其他的核 破坏死亡，形成较纯的变异菌落。
并且高剂量会引起难以恢复突变的巨大 损伤，促使变异菌株稳定，不易产生恢复 突变。
（2）抗噬菌体菌株的选育
噬菌体的感染常给工业生产造成巨大的损失。 而且噬菌体很容易发生变异，使对噬菌体原具 有抗性的菌株失去抗性，所以需要不断选育抗性 菌株。 有研究表明，细菌对噬菌体的抗性是基因突变 的结果，这种抗性可以发生在接触噬菌体以前， 与噬菌体的存在与否无关。
抗噬菌体菌株的筛选可采用自然突变和 诱发突变两种方法。
§4 菌种选育
尽管生产菌种最初均是来自于自然界,但天然 菌种的生产性能一般比较低下。优良菌种的选育为 生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种 产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品 质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。
特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为 定向技术的发展，使菌种选育技术不断更新，而产生 出众多有价值的微生物工程产品。主要的育种技术包 括： –自然选育 –诱变选育 –抗噬菌体菌种的选育 –杂交育种 –原生质体融合技术 –基因工程技术等
※在这些基因重组的过程中，并不涉及 整个染色体组，所形成的都是部分合子。
在细菌接合中，将带有两个以上不同选择性遗 传标记的两个菌株进行杂交。
细菌的其他方式杂交，如F因子转导、R因子转 移、转化和转导等，都需要出发菌株带有选择性 遗传标记，使杂交菌落容易识别，方便快速筛选。 如：营养缺陷、抗生素抗性、温度敏感、发酵性 能等。
产孢子多且早、对诱变剂敏感。 （3）用作诱变的出发菌种还必须了解它的产量、
形态、生理等方面的情况。 （4）可选择已经过诱变处理的菌种，因为这样
的菌种对诱变剂的敏感性会有所提高。
4.2.2.2 诱变剂的使用方法
在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱变 剂处理和复合诱变剂处理。
复合诱变剂处理：是指用两种以上的诱变方法 处理菌种。
这些变异的菌种可用各种方法筛选出来。
4.2.3.1 营养缺陷型突变菌株的筛选
营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理 论研究和工业应用意义，已广泛地在氨基酸、核 苷酸生产中获得应用。
在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端 产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克 服生长障碍，就能使中间产物积累。
4.3.2 放线菌的杂交
• 放线菌与细菌一样都是原核生物，只有一 条环状染色体。
• 但却象霉菌那样以菌丝形态生长，并形成 分生孢子。
• 其基因重组过程近似于细菌，但它们的育 种方法有许多与霉菌相似。
4.3.2.1放线菌的遗传体系和杂交原理
放线菌基本上有以下四种遗传体系：
（1）异核现象 （2）接合现象 （3）异核系的形成 （4）重组体的形成
4.2.3.2 抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变菌株的筛选
末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍 存在的，除了采用筛选营养缺陷型突变菌株，来降 低末端产物的浓度外，更加有效的办法是筛选抗阻 遏和抗反馈抑制突变株。
这两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的 表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时，仍 不断合成这一产物。但其代谢失调的原因不同。
通过杂交还可以：
（1）扩大变异范围； （2）改变产品的产量和质量； （3）甚至创造出新品种。
由于多数微生物尚未发现有性世代，因 此直接亲本菌株应具有适当的遗传标记， 如颜色、营养要求（即营养缺陷标记）、 或抗药性等。
4.3.1 细菌的杂交
细菌的杂交可以通过：
（1）细菌接合 （2）F因子转导 （3）R因子转移 （4）转化和转导等方法促使基因重组
4.3 杂交育种
生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生 活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、 代谢减慢、产量增加缓慢。