LC_MS_MS同时测定5种探针底物代谢产物和快速评价细胞色素P450同工酶的活
Cocktail探针药物法评价小檗碱对肝微粒体CYP450酶的抑制作用
Cocktail探针药物法评价小檗碱对肝微粒体CYP450酶的抑制作用目的：研究小檗碱对人肝微粒体CYP活性的影响。
方法：以苯海拉明为内标，建立LC-MS/MS同时测定5种探针药物：咪达唑仑、非那西丁、右美沙芬、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗的含量，采用鸡尾酒（cocktail）法探针药物法评价不同浓度小檗碱对混合人肝微粒体CYP不同亚型活性的影响。
结果：与对照组相比，咪达唑仑、非那西丁和甲苯磺丁脲的代谢速率基本没有变化，而氯唑沙宗的代谢速率明显变慢，对于右美沙芬，当小檗碱的质量浓度为50 μg·L-1时，其代谢速率基本没有变化，当小檗碱的质量浓度大于200 μg·L-1时，其代谢速率明显变慢。
结论：小檗碱质量浓度在2 000 μg·L-1以下时对人肝微粒体中CYP3A4，CYP1A2和CYP2C9活性没有明显影响，但对CYP2E1和CYP2D6有明显的浓度依赖性抑制作用。
标签：鸡尾酒法；探针药物；混合人肝微粒体；小檗碱；P450酶抑制细胞色素P450酶（CYP）是肝微粒體混合功能氧化酶系的主要成分，是多种药物在体内代谢的最主要酶系[1]。
药物代谢与其体内浓度和药理活性密切相关，与此同时，药物也会对CYP产生诱导或抑制作用，从而引发药-药物相互作用和不良反应[2]。
复方是中药临床用药常见形式，配伍是中药的特色和优势，研究中药和CYP的关系，不但可以揭示药物的体内代谢过程，而且有助于了解药物间的相互作用与药效之间的内在联系，为组方配伍和临床合理用药提供直接依据[3]。
小檗碱，是中药黄连、黄柏等的主要有效成分，在临床上一直作为抗菌药和清热解毒药，随着研究不断深入，发现其具有抗高血压、抗肿瘤、降血糖等多方面的药理作用[4]。
目前研究表明小檗碱主要由小肠吸收，其口服吸收较差，生物利用度较低[5]，有关小檗碱的肝代谢酶表征及代谢产物的研究较清楚，小檗碱主要由CYP1A2和2D6代谢，代谢产物为小檗红碱和去亚甲基小檗碱及其葡萄糖醛酸苷共价结合物[6-7]。
lc-ms的应用案例
lc-ms的应用案例LC-MS（液相色谱-质谱联用）是一种常用的分析技术，在许多领域都有广泛的应用。
下面列举了十个液相色谱-质谱联用的应用案例。
1. 药物代谢研究：LC-MS可用于药物代谢研究，通过分析药物在体内的代谢产物，可以了解药物的代谢途径和代谢动力学，为药物研发提供重要参考。
2. 食品安全检测：LC-MS可以用于检测食品中的农药残留、兽药残留、食品添加剂等有害物质。
通过分析样品中的目标物质和其代谢产物，可以评估食品的安全性。
3. 环境分析：LC-MS可用于环境样品中有机污染物的分析，如水体中的有机污染物、大气中的挥发性有机物等。
通过确定目标物质的种类和含量，可以评估环境的污染程度。
4. 蛋白质组学研究：LC-MS在蛋白质组学研究中起到重要作用。
通过分析样品中的蛋白质组成和修饰信息，可以了解蛋白质在生物学过程中的功能和调控机制。
5. 代谢组学研究：LC-MS可用于代谢组学研究，通过分析生物体内的代谢产物，可以了解代谢物的种类和变化规律，为疾病诊断和治疗提供依据。
6. 药物残留检测：LC-MS在药物残留检测中有广泛应用。
通过分析样品中的目标物质和其代谢产物，可以准确测定药物的残留水平，保障药品的安全使用。
7. 生物样品分析：LC-MS可用于生物样品中目标化合物的定量分析，如血液、尿液、组织等。
通过分析样品中的目标物质和其代谢产物，可以了解生物样品的化学组成和代谢过程。
8. 天然产物分析：LC-MS在天然产物研究中有重要应用。
通过分析植物、动物等样品中的天然产物，可以鉴定和定量目标化合物，为天然产物的开发和利用提供科学依据。
9. 肽段分析：LC-MS可以用于肽段的分析和鉴定。
通过分析样品中的肽段组成和序列，可以了解肽段的结构和功能，为肽药物的研发和应用提供基础数据。
10. 新药研发：LC-MS在新药研发中有重要应用。
通过分析药物的质谱信息和代谢产物，可以了解药物的药代动力学、药效学和毒理学特性，为新药研发提供支持。
喜炎平注射液对人肝微粒体P450酶活性的影响_叶林虎
由表 1 可见，所得各值均在文献报道［6 －10］范围内。
表 1 阳性抑制剂 IC50 值 Table 1 IC50 value obtained in this work using the substrate cocktails
阳性抑制剂对 P450 酶活性 建立人肝微粒体体 外孵育反 应 体 系［5］。 体 系 中 含 人 肝 微 粒 体 蛋 白 的 终 浓度 为 0. 3 mg · mL － 1 ； 探 针 底 物 终 浓 度 如 下 （ μmol·L － 1 ） ： 奥美拉唑 50，右美沙芬 5，睾酮 50，氯 唑沙宗 50，甲苯磺丁脲 150，制成混合溶液。终浓度 （ mmol · L － 1 ） ： NADPH 溶 液 为 1. 0，MgCl2 为 3. 3，
1200 高效液相色谱仪，美国 Agilent 产品； pH 计 与 XS105S 电子分析天平，瑞士 Mettler Toledo 产品； Legend Micro 21Ｒ 微 量 冷 冻 离 心 机，美 国 Thermo Scientific产品。 2 样品溶液配制
精密称取 5 个探针药物及其代谢物和 2 个内标 化合物（ 普萘洛尔和格列齐特分别用于正负模式） 对 照品 各 5 mg，分 别 用 适 量 甲 醇 或 水 溶 解，配 制 成 5 mg·mL － 1 溶液 作 为 贮 备 液，保 存 于 － 80 ℃ 冰 箱。 喜炎 平 注 射 液 用 超 纯 水 稀 释 为 50，25，5，1，0. 5 mg·mL － 1 （ 以穿心莲内酯总磺化物计算） 的溶液作为 贮备液，保存于 － 20 ℃ 冰箱，备用。 3 观察药物对 P450 酶活性的作用
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
C还原酶传递，还原成P-450 Fe2+药物。 • 接受一分子氧：P450 Fe2+药物中的低铁血红素能与分子氧结合。 • 再接受电子还原： O2—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供
谢谢大家
药物相互作用实验过程
• 采用与代谢稳定性一致孵育体系，冰浴上加入1 µL的一系列浓度的待 测化合物（1、10、100、1000、10000 µM）和1 µL的各特异性探针 底物（空白对照样品不加待测化合物，只加等量溶剂），在37 ℃水 浴中预热5 min，然后冰浴上加入5 µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据 不同的探针底物在37 ℃水浴中孵育10~30 min，加入有机溶剂混匀终 止反应，每个浓度组设3个平行样品。其中待测化合物浓度为0.01、 0.1、1、10、100 µM。反应结束后，采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量，考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
实验过程和代谢稳定性实验一致只是选用的肝微粒体为几种不同种属不同种属的代谢稳定性实验?采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系一致的实验过程分别加不同种属的肝微粒体酶孵育通过不同种属中药物剩余量的百分比的对数与反应时间做曲线求斜率计算不同种属的代谢半衰期和清除率比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接近程度最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考
UPLC—MSMS法同时测定人血浆中卡马西平、文拉法辛、罗格列酮和硝苯地平的浓度
UPLC—MS/MS法同时测定人血浆中卡马西平、文拉法辛、罗格列酮和硝苯地平的浓度作者：王伟丁仁奎李清艳祁妍敏来源：《中国药房》2018年第02期中圖分类号 R969.1；R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）02-0194-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.13摘要目的：建立同时测定人血浆中卡马西平、文拉法辛、罗格列酮和硝苯地平浓度的方法。
方法：血浆样品经甲醇（含0.1%甲酸）沉淀蛋白后，以盐酸吡格列酮为内标，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定。
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS C18，流动相为含0.01%甲酸的水溶液-含0.01%甲酸的甲醇溶液（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，柱温为50 ℃，进样量为5 μL；采用电喷雾离子源，以多反应监测模式进行正离子扫描，用于定量分析的离子对分别为m/z 237.00→194.05（卡马西平）、m/z 278.20→58.10（文拉法辛）、m/z358.08→135.04（罗格列酮）、m/z 347.15→315.17（硝苯地平）、m/z 357.09→134.06（内标）。
结果：卡马西平、盐酸文拉法辛、盐酸罗格列酮、硝苯地平血药浓度的线性范围分别为2.00～2 000.00、2.12～2 120.00、2.00～2 000.00、2.04～1 020.00 ng/mL（r分别为0.995 9、0.990 5、0.991 5、0.991 0，n=5），最低检测限分别为0.200、0.106、0.100、1.020 ng/mL；日内、日间RSD均小于15%，相对误差的绝对值小于15%；提取回收率为65.66%～96.36%（RSD关键词卡马西平；文拉法辛；罗格列酮；硝苯地平；血药浓度；超高效液相色谱-串联质谱法ABSTRACT OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of carbamazepine， venlafaxine， rosiglitazone and nifedipine in human plasma. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted to determine plasma sample after precipitated with methanol （containing 0.1% formic acid） using pioglitazone hydrochloride as internal standard. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC HSS C18 column with mobile phase consisted of aqueous solution containing 0.01% formic acid-methanol containing 0.01% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 50 ℃， and sample size was 5 μL. ESI was used for positive ion scanning by multi reaction monitoring mode. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 237.00 to 194.05 （carbamazepine）， m/z 278.20 to 58.10 （venlafaxine）， m/z 358.08 to 135.04 （rosiglitazone）， m/z 347.15 to 315.17 （nifedipine），m/z 357.09 to 134.06 （internal standard）. RESULTS： The liner ranges of carbamazepine，venlafaxine hydrochloride， rosiglitazone hydrochloride and nifedipine were 2.00-2 000.00（r=0.995 9，n=5）， 2.12-2 120.00（r=0.990 5， n=5）， 2.00-2 000.00（r=0.991 5， n=5）and 2.04-1 020.00（r=0.991 0，n=5） ng/mL； the minimum detection limits were 0.200， 0.106，0.100， 1.020 ng/mL， respectively. RSDs of inter-day and intra-day were less than 15%. The absolute values of RE were less than 15%. The extraction recoveries were 65.66%-96.36%（RSD%KEYWORDS Carbamazepine； Venlafaxine； Rosiglitazone； Nifedipine； Plasma concentration； UPLC-MS/MS卡马西平是治疗简单部分性和复杂部分性癫痫的首选药物，但其安全范围小、有效剂量个体差异大，易引起不良反应（多与其环氧化物有关），如骨髓抑制、剥脱性皮炎等[1]。
苯环喹溴铵药理毒理研究进展
苯环喹溴铵药理毒理研究进展刘红1王宝辉1王宇1张俊毅1王祥艳1孙艾楠1程颜彬1赵李宏2（1白求恩医科大学制药厂，吉林长春130012；2吉林省成大方圆医药连锁有限公司，吉林长春130041）【摘要】变应性鼻炎和慢性阻塞性肺病是当前两种发病率高、发病人群广泛、病程缠绵且危害显著的呼吸系统疾病。
作为有针对性的新一代治疗药物，苯环喹溴铵是我国自主研发的具有自主知识产权的国家一类新药，具有广阔的应用前景。
【关键词】苯环喹溴铵；药理；毒理；研究进展Research progress of pharmacological effects and toxicological informationof bencycloquidium bromideLIU Hong1 WANG Bao-hui1WANG Y u1 ZHANG Jun-yi1 W ANG Xiang-yan1 SUN Ai-nan1CHENG Y an-bin1 ZHAO Li-hong2(1 Pharmaceutical Factory Norman Bethune University of Medical Science，Jilin Changchun 130012；2 Cheng DaFang Y uan Pharmaceutical Co,Ltd of Jilin Province，Jilin Changchun 130041)【Abtract】At present, allergic rhinitis and chronic obstructive pulmonary disease are the two kinds of respiratory diseases, with the features of high incidence、widespread population incidence、long course and remarkable harm. As a new generation of targeted therapeutic drug, bencycloquidium bromide is an independent intellectual property rights and national class of drug that would get broad application prospect. 【KeyWords】bencycloquidium bromide；pharmacological effects；toxicological information；research progress变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称为过敏性鼻炎，是特应性个体接触致敏源后导致的，包含IgE介导的炎症介质释放和多种免疫活性细胞因子、细胞因子参与的鼻黏膜慢性反应性疾病。
超高效液相色谱法检测6种探针底物代谢产物并评价人细胞色素P450同工酶活性
超高效液相色谱法检测6种探针底物代谢产物并评价人细胞色素P450同工酶活性陆苑;谢玉敏;潘洁;黄勇;王永林【摘要】目的：建立同时测定非那西丁（CYP1A2）、氯唑沙宗（CYP2E1）、甲苯磺丁脲（CYP2C9）、奥美拉唑（CYP2C19）、睾酮和咪达唑仑（CYP3A4）6种探针底物代谢产物的Cocktail体外方法，评价药物对人肝微粒体CYP450同工酶活性的影响。
方法：人肝微粒体与6种探针底物在还原系统NADPH的作用下，37℃共同孵育；以蛋白沉淀法处理样品，采用超高效液相色谱系统（ UPLC-MS/MS），建立Cocktail混合探针，对药物的6种代谢物进行定量分析，并分析药物对人肝微粒体CYP450同工酶活性的影响。
结果：6种探针底物物代谢产物乙酰氨基酚（0.26～8.35μmol/L）、6-羟基氯唑沙宗（3.02～96.63μmol/L）、5-羟基奥美拉唑（0.10～3.09μmol/L）、羟基甲苯磺丁脲（0.15～4.88μmol/L ）、6β-羟基睾酮（3.67～117.37μmol/L ）和α-羟基咪达唑仑（1.64～52.37μmol/L）线性关系良好，各成分相关系数（R2）＞0.996，准确度为95.96％～103.10％，日内和日间精密度RSD（％）＜15％，提取回收率、基质效应RSD（％）＜11％，稳定性好。
结论：UPLC-MS/MS准确、灵敏度高，可作为研究受试药物对CYP450酶影响及相关研究的分析测定方法。
%Objective:To establish cocktail method for simultaneous determination of 6 kinds of probe substrate metabolites:phenacetin and chlorzoxazone ( CYP1 A2 ), CYP2 E1 , tolbutamide (CYP2C9),omeprazole(CYP2C19),testosterone and midazolam(CYP3A4)in vitro,evaluating the effects of medicine on human liver microsomesˊCYP450 isozyme activity. Methods:Under the func-tion of NADPH,human liver microsomes interacted with 6 kinds of probesubstrates at 37℃. Using protein precipitation to handle the samples. Adopting UPLC/MS/MS and establishing Cocktail mixed probes to carry out quantitative analysis on the 6 kinds of metabolites,analyzing the effect of medicine on human liver microsomesˊCYP450 isozyme activity. Results:A good linear relationship was found in acetaminophen(0. 26~8. 35 μmol·L-1 ),6-hydroxy chlorzoxazone(3. 02~96. 63 μmol·L-1 ),5-hydroxy omeprazole(0. 10~3. 09 μmol·L-1 ),hydroxytolbutamide(0. 15~4. 88μmol·L-1 ),6-β-hydroxy testosterone(3. 67~117. 37 μmol·L-1 )and alpha-hydroxy midazolam(1. 64~52. 37 μmol· L-1 ). The correlationcoefficient( R2 )were greater than 0 . 996 . The data showed that accuracy range was 95 . 96% ~103 . 10%,RSD(%)of intra-day and inter-day precision were less than 15%,RSD (%)of extraction recovery and matrix effect were less than 11%,as well as excellent stability. Con-clusion:The method is accurate and sensitive,which can serve as a good analysis mean for effect of researching drugs on cytochrome P450 enzymes and related research.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】6页(P560-565)【关键词】色谱法,液相;细胞色素P450酶系统;肝微粒体;Cocktail探针药物法【作者】陆苑;谢玉敏;潘洁;黄勇;王永林【作者单位】贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学药学院民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R963随着代谢性药物相互作用引起的不良反应案例逐年增多，对于药物间的相互作用的有效预测就显得尤为必要。
LC_MS_MS法同时测定洛匹那韦和利托那韦的血浆浓度
LC-MS/MS法同时测定洛匹那韦和利托那韦的血浆浓度姚亚敏1, 孙建军2, 陈军2, 刘晓茜1, 卢洪洲1, 3*, 张丽军1*(1. 上海市公共卫生临床中心, 上海 201508; 2. 复旦大学上海医学院, 上海 200032;3. 复旦大学附属华山医院, 上海 200040)摘要: 建立液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 测定人血浆中洛匹那韦 (LPV)、利托那韦 (RTV) 的浓度。
血浆样品经碱化沉淀蛋白后, 经乙酸乙酯液-液萃取, 以甲醇-0.1%甲酸水溶液 (80∶20) 为流动相, Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mm × 4.6 mm ID, 5 μm) 柱分离; 采用电喷雾电离源, 以多反应监测 (MRM) 方式进行正离子检测, 用于定量分析的离子对LPV为629.6→155.2, RTV为721.4→268.2, 内标替米沙坦 (TEL) 为515.2→276.2。
测定血浆中LPV线性范围为62.5～10 000 ng·mL−1, 检测限为15 pg·mL−1, RTV的线性范围为12.5～2 000 ng·mL−1, 检测限为8 pg·mL−1, r均大于0.99。
日内和日间精密度均小于15%, 提取回收率均大于75%。
该法选择性强、灵敏度高、重现性好, 能同时快速、准确测定人血浆LPV和RTV浓度, 为临床治疗药物浓度监测 (TDM) 奠定基础。
关键词: 洛匹那韦; 利托那韦; 液相色谱-串联质谱法; 血药浓度中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2010) 02-0279-04LC-MS/MS method for simultaneous quantification of lopinavirand ritonavir in human plasmaYAO Ya-min1, SUN Jian-jun2, CHEN Jun2, LIU Xiao-qian1, LU Hong-zhou1, 3*, ZHANG Li-jun1* (1. Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China; 2. Shanghai Medical College, Fudan University,Shanghai 200032, China; 3. Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)Abstract: A liquid chromatographic-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method was developed for the determination of lopinavir and ritonavir in human plasma. Analytes were separated from plasma by a combination of alkalinized protein precipitation and liquid-liquid extraction with ethyl acetate. Chromatographic separation was performed on a Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column with the mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid in water (80∶20). A tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used as detector and operated in the positive ion mode. Quantification was performed using multiple reaction monitoring (MRM) of the transitions m/z 629.6 → 155.2, m/z 721.4 → 268.2, and m/z 515.2 → 276.2 for lopinavir, ritonavir and telmisartan (internal standard), respectively. The method showed a good linearity in a concentration range of 62.5 − 10 000 ng·mL−1 for lopinavir, and 12.5 − 2 000 ng·mL−1 for ritonavir. The lower limits of quantification were 15 pg·mL−1 and 8 pg·mL−1 for lopinavir and ritonavir, respectively. The intra- and inter-day precision was less than 15% and the absolute recovery was above 75%. This method was selective and rapid, sensitive for investigating blood drug concentrations in clinics.Key words: lopinavir; ritonavir; LC-MS/MS; plasma concentration收稿日期: 2009-06-24.基金项目: 卫生部艾滋病防治研究资助项目 (WA-2007-04).*通讯作者 Tel: 86-21-37990333-5368,E-mail: zhanglijun1221@; luhongzhou@近期上市的Kaletra是洛匹那韦 (lopinavir, LPV) 和利托那韦 (ritonavir, RTV) 的复合制剂, 洛匹那韦和利托那韦是目前经FDA批准上市的HIV蛋白酶抑制剂。
黄葵总黄酮对CYP450酶的抑制作用
学 报Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（2）：208 - 217208黄葵总黄酮对CYP450酶的抑制作用许瑶，彭英，王广基*，孙建国**（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京 210009）摘 要 研究黄葵总黄酮对人肝微粒体中细胞色素P450（CYP450）酶不同亚型的影响机制并在大鼠体内对受抑制最为显著的CYP2C9亚型进行验证。
利用HPLC-MS/MS技术，通过鸡尾酒法在体外评估黄葵总黄酮对人CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP1A2和CYP2D6的抑制效应，考察其抑制机制，计算酶抑制动力学参数。
在大鼠体内通过比较单次或多次给药200 mg/kg黄葵总黄酮与等剂量CMC-Na后甲苯磺丁脲的药代动力学行为差异，评估黄葵总黄酮对大鼠CYP2C11酶（CYP2C9同工酶）的影响。
结果表明黄葵总黄酮对CYP2C9和CYP2E1存在显著抑制作用，IC50分别为3.22和8.64 µg/mL，对其他亚型也表现出一定的抑制作用，IC50介于20~30 µg/mL。
黄葵总黄酮并非为潜在的时间依赖性抑制剂，它能竞争性抑制CYP2E1和CYP2C9，抑制常数K i分别为3.84和6.33 µg/mL，对CYP3A4介导的睾酮-6β-羟基化和咪达唑仑-4-羟基化的抑制方式为非竞争性抑制，K i分别为7.37和3.32 µg/mL，同时它也是CYP1A2、CYP2D6和CYP2C19的非竞争性抑制剂，K i分别为8.66、11.49和21.94 µg/mL。
在大鼠体内，黄葵总黄酮并没有引起大鼠体内CYP2C11探针底物甲苯磺丁脲药动学行为的改变，但影响了其代谢物4-羟基甲苯磺丁脲的AUC0-t、c max等参数（P < 0.05）。
因此在临床研究中应当考察可能存在的CYP450酶介导的药物-药物相互作用。
超高效液相串联质谱法同时定量检测6个细胞色素P450酶探针代谢产物
超高效液相串联质谱法同时定量检测6个细胞色素P450酶探针代谢产物沈国林;钟玉环;原梅;庄笑梅;李桦【摘要】应用超高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS),建立了同时定量测定6个细胞色素P450酶(CYP)探针代谢产物的方法.用甲醇和乙腈混合溶剂沉淀肝微粒体孵育液中的蛋白,在ZORBAX-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,35μm)上,以5 mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸-乙腈为流动相,梯度分离待测物.在串联质谱正离子多反应监测模式下定量检测待测物.方法学验证结果表明,6个代谢产物在1.0 ～1000.0 μg/L的范围内均呈良好的线性关系(r2 ＞0.994)；定量限为1μg/L;方法的日内和日间精密度(RSD)均小于12％；加标回收率为92.8％～ 104.4％；不同储存条件下样品稳定性实验的浓度偏差(RSD)小于10％.人肝微粒体活性测定的结果显示CYP1 A2和CYP3 A4的酶活性最强,分别为(466.1 ±32.1)和(694.3±11.7) pmole/(mg·min),与最低的CYP2C19酶活性分别相差27.7和41.3倍.本方法简便、快速、灵敏,适用于大量化合物CYP酶诱导和抑制评价的酶活性测定.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2013(041)004【总页数】6页(P488-493)【关键词】细胞色素P450酶;探针底物;代谢产物;液相色谱-质谱联用;肝微粒体【作者】沈国林;钟玉环;原梅;庄笑梅;李桦【作者单位】军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850【正文语种】中文1 引言细胞色素P450酶(CYP)是重要的药物代谢酶，参与了约75%临床药物的体内代谢［1，2］。
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途径的信息可在单个实验过程获得，由于其具有快速、 ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＤＰＨ）购于瑞士 Ｒｏｃｈｅ
有效、经济的特点而受到国内外学者的青睐，不但在制 公司。酮康唑（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ，ＫＥＴ）、氟康唑（ｓｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅ，
药工业界药物代谢早期筛选阶段得到广泛使用，而且还 ＳΜＬ）、噻氯匹定（ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ，ＴＩＣ）购于中国药品生物制
物相互作用信息对于新药的利益 － 风险评价至关重要［７］。 （Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ，ＰＮ）、格列齐特（Ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ，ＧＬ）等购于美国
有效的预测药物间相互作用，不仅能为新药的开发降低 Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｄｒｏｘｙ－
风险，同时还能为临床用药的安全性和有效性提供保 ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ，ＯＨＴＢ）、６β－ 羟基睾酮（６β－ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓ－
发布了相应的药物相互作用研究指南［６］，并强调评价新 ｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ，ＯＨＯＰＺ）、６－ 羟 基 氯 唑 沙 宗（６－ｈｙｄｒｏｘｙ－
化学实体对 ＣＹＰ 酶的诱导和抑制作用的必要性和重要 ｃｈｌｏｒｚｏｘａｚｏｎｅ，ＯＨＣＺＸ）、奎尼丁（ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ，ＱＮＤ）、二 乙
性。因此，新药候选物对代谢酶的作用及可能导致的药 基二硫代甲酸酯（ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ，ＤＩＥ）、普萘洛尔
等属于麻醉药品，市场上很难获得，使该方法的推广及 成 １ ｍｇ·ｍＬ－１ 溶液作为贮备液，保存于 －８０℃冰箱备用。
运用受限。因此，本文根据 ＦＤＡ 指南，采用便宜易得的 ２．１．２ 标准基质样品和质控样品的配制 分别精密吸取
奥美拉唑、右美沙芬、睾酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲分别 ＯＨＯＰＺ、ＯＨＣＺＸ、ＤＸ、ＯＨＴＳ、ＯＨＴＢ 适量，混合后用 ８０％
用。其中 ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１和 ＣＹＰ２Ｃ９ 是 ＣＹＰ 最主要的亚型，市场上 ９０％左右经肝脏代谢的 药物都是由这 ５ 种酶代谢的［１，２］。抑制或诱导 Ｐ４５０ 酶都可 能会产生相应的药物 － 药物相互作用，给患者的治疗增 加风险，有的甚至是危及生命。近半个世纪来，全球撤市 了近百个产品［３，４］，其中很多就是因为发生严重的药物相 互作用而被撤出市场［５］。
体体外模型，并进行方法学验证，为体外快速预测潜在 样品。
的药物相互作用提供参考。
２．３ 肝微粒体酶体外孵育反应体系
１ 材料
体外孵化反应体系含有人肝微粒体蛋白（０．３ ｍｇ·ｍＬ－）１ ，
１．１ 仪器
ＮＡＤＰＨ（１．０ ｍｍｏ·ｌ ｍＬ－）１ ，混合探针底物 ＴＳ、ＤＭ、ＯＰＺ、ＴＢ、
ＱＴｒａｐ－３２００ 液相色谱 － 质谱联用仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ－ ＣＺＸ（最终浓度分别为 ５０、５、５０、１５０、５０μｍｏ·ｌ ｍＬ－）１ ，ＭｇＣｌ（２ 浓 ｔｅｍ，美国）；Ａｎａｌｙｓｔ １．４．２ 数据处理系统（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ， 度为 ３．３ｍｍｏ·ｌ ｍＬ－）１ ，Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４缓冲液（１００ｍｍｏ·ｌ ｍＬ－１，
士）和多功能酶标仪（Ｂｉｏｔｅｋ，美国）。
孵育 ３０ ｍｉｎ 后，加入冰冷的含内标的乙腈溶液 １００μＬ 终
１．２ 药品与试剂
细胞色素 Ｐ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ）是药物代谢 的 主 要 酶 系 ，在 药 物 的 Ⅰ 相 代 谢 中 发 挥 至 关 重 要 的 作
基金项目：科技部对欧盟科技合作专项（１１０８）和重大新药创制“科 技重大专项”（２０１２ＺＸ０９３０１００２－００１）。 作者简介：叶林虎，男，在读博士，药物代谢研究。 ＊ 通讯作者：常琪，女，博士生导师，药物代谢研究。 Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｃｈａｎｇ＠ｉｍｐｌａｄ．ａｃ．ｃｎ
美国）；Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２１Ｒ 微量冷冻离心机（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ－ ｐＨ ７．４），将反应体系在 ３７℃恒温水浴摇床中预孵化 １０ ｍｉｎ
ｔｉｆｉｃ，美国）；超纯水器（Ｍｉｌｉ－ＱⅡ，美国）；ＭＥＴＴＬＥＲ ｐＨ 后加入 ＮＡＤＰＨ 启动反应，总体积为 １００μＬ，且最终反应体
计；ＭＥＴＴＬＥＲ ＸＳ１０５Ｓ 电子分析天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，瑞 系中甲醇的含量不超过 １％［９，１０］。在 ３７℃恒温水浴摇床中
障。Ｃｏｃｋｔａｉｌ 探针底物法是一次给予两种或多种的探针 ｔｅｒｏｎｅ，ＯＨＴＳ）购于加拿大 Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ。
底物同时获取多个信息的方法［８］。其优点在于多个代谢 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 还 原 酶（β－ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ
的原型而不是采用探针底物的代谢产物。这样会导致方 ２ 方法
法的准确性和专一性受损，而体外方法报道较少。国外 ２．１ 溶液配制
虽有一些建立体外方法的报道，但是其所用的探针底物 ２．１．１ 标准贮备液配制 精密称取 ５ 个探针药物代谢产
及其代谢产物如咖啡因，咪达唑仑和 １－ 羟基咪达唑仑 物和内标对照品各 ２ ｍｇ，分别溶于 ２ ｍＬ 甲醇中，配制
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中国药物警戒第 １０ 卷第 ５ 期 ２０１３ 年 ５ 月 Ｍａｙ， ２０１３， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ．５
国家食品药品监督管理总局（ＣＦＤＡ）和美国食品药 拉唑（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ，ＯＰＺ）、氯唑沙宗（ｃｈｌｏｒｚｏｘａｚｏｎｅ，ＣＺＸ）、
品监督管理局（ＦＤＡ）都非常重视药物相互作用的危害， 右菲烷（ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ，ＤＸ）、５－ 羟基奥美拉唑（５－ｈｙｄｒｏｘ－
被用来预测、评价已上市药物联合用药的潜在风险。
品检定所。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠购自北京世纪红星化
目前，国内已有建立同时测定多个探针底物的大鼠 工有限责任公司。氯化镁购于国药化学试剂有限公司。
和小鼠体内方法，但在分析方法上主要是采用探针底物 色谱纯乙腈、甲醇购于美国 Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司。
作为 ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ９ 的 甲醇稀释至 １ ｍＬ，配制成浓度分别为 ４、４、８、２．４、８、４μｇ·ｍＬ－１
探针底物，以其羟基化和去甲基化的专一性代谢产物作 的混合标准品工作液。取此标准液适量与失活的肝微粒
为分析指标，建立新组合的 Ｃｏｃｋｔａｉｌ 探针底物人肝微粒 体蛋白液、缓冲液配制成各物质的标准基质样品和质控
摘要：目的 建立同时测定奥美拉唑（ＣＹＰ２Ｃ１９）、右美沙芬（ＣＹＰ２Ｄ６）、睾酮（ＣＹＰ３Ａ４）、氯唑沙宗（ＣＹＰ２Ｅ１）和甲苯磺 丁脲（ＣＹＰ２Ｃ９）５ 种探针底物代谢产物的 Ｃｏｃｋｔａｉｌ 体外方法，快速评价药物对人肝微粒体细胞色素 Ｐ４５０ 同工酶活性 的影响。方法 通过人肝微粒体与 ５ 种探针底物在还原系统 ＮＡＤＰＨ 的作用下，于 ３７℃水浴条件下共同孵育，采用液 质联用（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析方法，测定探针底物的代谢产物生成量来评价各 Ｐ４５０ 同工酶的活性。结果 建立了同时测 定 ５ 种 Ｐ４５０ 同工酶活性的酶反应条件和 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ 分析方法，数据显示该方法具有良好的线性和分析灵敏度，以 及具有良好的准确度、精密度、重现性，可用于药物间相互作用的体外快速评价。结论 可用于体外快速评价药物对 相应的 ＣＹＰ４５０ 亚型酶活性的影响，以预测潜在的药物相互作用。 关键词：细胞色素 Ｐ４５０；Ｃｏｃｋｔａｉｌ；ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ；药物相互作用；体外
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｉｖｅ Ｍａｊｏｒ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ａｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ａｓｓａｙ YE Lin-Hu KONG Ling-Ti XIAO Bing-Xin WANG Qian HE Xiao-Xi CAO Fang-Rui CHANG Qi＊ (Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China) Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To develop an in vitro Cocktail method coupled with liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) assay for simultaneous determination of the activities of five major cytochrome P450 (CYP450) isoenzymes by monitoring the metabolites of five probe substances including omeprazole(CYP2C19), dex－ tromethorphan(CYP2D6), testosterone(CYP3A4), chlorzoxazone(CYP2E1), tolbutamide(CYP2C9). Ｍｅｔｈｏｄｓ The five probes were incubated with human microsome CYP450 isoenzymes at 37 ℃ in the presence of NATPH. The concentrations of produced metabolites in the reaction solution were determined by LC-MS/MS method, and compared for evaluating the activities of isoenzymes. Ｒｅｓｕｌｔｓ The various conditions for enzyme reactions and LC-MS/MS method have been established for monitoring the activities of five CYPP450 isoenzymes. The data showed that the method possessed a good linearity and sensitivity, as well as the excellent accuracy and repeatability, and can be used for the rapid evaluation of drug-drug interactions. Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ A sensitive and validated Cocktail Method coupled with LC-MS/MS assay has been developed and can be applied to rapidly evaluate the CYP450 enzyme activities for predicting the potential drug-drug interactions. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： P450; Cocktail; LC-MS/MS; drug-drug interactions; in vitro