糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制
海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制
海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：海藻糖和蔗糖是两种常见的保护剂，它们能够有效地保护生物大分子免受氧化和降解的影响。
海藻糖具有很强的保水性和抗氧化性，可以在细胞内形成稳定的结构，保护mRNA的完整性。
蔗糖则具有较好的保护膜作用，可以包裹mRNA分子，阻止其与外界环境发生不必要的接触。
将海藻糖和蔗糖复合使用，可以充分发挥它们的保护作用，提高mRNA的稳定性和传递效率。
mRNA-LNP技术是一种将mRNA包裹在脂质纳米颗粒中，作为载体传递到细胞内的技术。
这种技术可以有效提高mRNA的稳定性和细胞摄取率，促进基因编辑和蛋白表达。
海藻糖蔗糖mrna-lnp复合物可以进一步增强脂质纳米颗粒的稳定性和传递效率，帮助mRNA更好地达到目的细胞并发挥作用。
冻干技术是一种将生物制剂在低温条件下冻结干燥，制备成粉末或块状的方法。
这种技术可以有效地保护生物制剂免受温度、湿度和光照等因素的影响，延长其保存期限和稳定性。
海藻糖蔗糖mrna-lnp 冻干保护剂可以将mRNA-LNP复合物冻干成粉末或块状，便于运输、保存和使用，同时提高mRNA的稳定性和传递效率。
海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制是一种有效提高mRNA稳定性和传递效率的方法。
海藻糖和蔗糖作为保护剂具有良好的保护性能，可以与mRNA-LNP复合物结合使用，进一步提高其稳定性和传递效率。
冻干技术则可以将复合物制备成易于运输和保存的形式，便于实际应用。
相信随着科研人员不断的努力和探索，海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制将在基因编辑和药物疗法领域发挥重要的作用，为人类健康做出贡献。
第二篇示例：随着生物技术的不断发展，mRNA疗法被认为是一种有望革命性改变药物开发领域的创新技术。
mRNA疗法面临着许多挑战，其中之一就是mRNA的不稳定性和易降解性。
为了克服这一挑战，科学家们不断探索新的保护机制，其中海藻糖和蔗糖作为载体被广泛应用。
冷冻干燥的保护剂及添加剂
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
蛋白冻干保护剂
5.7 冷冻干燥配方需要注意的问题
• 由于生物物料中活性组分各不相同，因而一般均须针 对物料单独配方。为了确保生物制品冷冻干燥后最大 程度地获得活性恢复率，必须充分考虑各种保护剂和 添加剂与生物制品活性组分之间的最大相容性。
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2.缓冲剂的选择
• 有许多缓冲剂能够用于生物制品的冷冻干燥配方中，但是，并 非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液，例如，对pH敏感的蛋白 质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲剂，这是由于在冻结过程 中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的pH值降低，最终引起 蛋白质变性。 • 另外，正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。例如， β-牛乳糖 水溶液（2μg/ml）冷冻干燥过程中，因为甘露醇结晶而不能起 到保护作用。当添加浓度为10mM的磷酸盐缓冲液（pH7.4）后， 部分抑制了甘露醇的结晶，并且酶的活性达到95%；而将磷酸 盐缓冲液（pH7.4）的浓度提高到200mM就能够完全抑制甘露 醇结晶。
波 长cm-1 ------天然蛋白质溶液 —含有添加剂的蛋白质溶液 干扰素-γ分别在冷冻干燥固体状态和复水后的频谱图 School of Medical Instrument and Food Engineering
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• 由于添加剂之间的物理作用是相互的，因此保持各添加剂 之间的相对合适含量是很重要的。如果某种添加剂同时能 起到几种功能，如有的糖既能起到低温保护剂的功能，又 能起到冻干保护剂的功能，那么它应当是首选的添加剂。 • 另外，应当尽量避免大量使用缓冲剂或盐类，因为它们有 可能在冻结过程中改变pH值，也有可能降低配方的玻璃化 转变温度。
蛋白冻干保护剂
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• 生物制品中活性组分如蛋白质也属于聚合物，具有较高的玻璃化 转变温度。因此，提高蛋白质与赋形剂之间的质量比率也可以明 显提高生物制品冷冻干燥配方的玻璃化转变温度；并且，提高蛋 白质的浓度还可以抑制赋形剂的结晶。当然，蛋白质的浓度也不 能提高得太多，否则会因为没有足够的保护剂而使得蛋白质发生 变性。 • 某些盐类也可用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂。然而这 可能会降低溶液的玻璃化转变温度。所以在生物制品配方中应当 尽量少地使用盐。
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5.8 冷冻干燥配方举例
• 一般来讲，蛋白质配方中固体成分含量在2%-10%之间。当 固体含量低于2%时，不能形成结实的冻干产品；而固体含 量高于10%时，又不能很好地进行冷冻干燥，即使冷冻干燥 完成，也会给复水带来困难。
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2） 水替代假说
由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋 白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后， 保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质 表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位 置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构 和功能的完整性。
生物药品冷冻干燥的研究
类型川，如表ｌ所示。
表ｌ生物药品冻干常用的冻干保护剂
对于生物药品冻干保护剂的选择，Ｃ垒亚曼ｎ！盟独Ｐｉｋａｌ㈣总结了为：（１）冻干保护剂可全 部或部分玻璃化；（２）冻干保护剂的玻璃化温度Ｔｇ应尽量高。
Ｃｒｏｗｅ ｆ５６】认为：为有效的保护生物药物的活性，仅样品在玻璃化温度以下保存是不够的，
在冻干干燥过程中，干燥层的温度要始终低于其塌陷温度Ｔｃ。对于搁板加热式冻干机， 升华干燥过程中，只要控制样品冻结层的温度低于其共晶温度或玻璃化转变温度，其干燥层 的温度一般不超过其塌陷温度。而对于辐射加热的冻干机，塌陷温度是工艺过程控制中的一 个重要参数。 ３．２冻干过中的压力控制
在冻干过程中，升华的水蒸气从升华界面通过多孔干燥层时的阻力，比由干燥层外表面
３生物药品冻干工艺控制参数与冻千保护剂
３．１共晶点温度Ｔｅ、玻璃化转变温度Ｔｇ和塌陷温度Ｔｃ 共晶点温度Ｔ。、玻璃化转变温度Ｔｇ和塌陷温度Ｔｃ是冻干工艺参数控制中最重要的三个参
数。三参数即相互独立，又具有一定的联系，三参数对冻干工艺控制设计有重要的意义。 （１）共晶点温度Ｔｅ。共晶点温度指在溶液降温过程中，当溶液被冷却到冰点时，开始
生物药品主要包括蛋白类药品、激素、病毒、疫苗、细菌、酵母、抗生素、抑制剂、脂 质体等。在生物药品领域，冷冻干燥技术是一项极为重要的制剂工艺，据文献报道，约有１４％ 的抗生素类药品需要冻干，约有９２％的生物大分子类药品需要冻干，约有５２％其它生物制剂 需要冻干｛３ｌ。生物药品冷冻干燥过程是将含水药品冻结成固态后，在低温、真空状态下，使其 中水分升华或解吸出去，以达到药品能长期保存的一种方法。药品冻干技术涉及到传热传质 学、制冷技术、真空技术、自动控制、生物化学、药剂学等学科。对生物药品的冷冻干燥与 冻干过程中动态参数测量及控制方法的研究对提高医药工业技术水平具有特殊重要的意义。
植物冷冻干燥过程中单糖的转运和稳定性
植物冷冻干燥过程中单糖的转运和稳定性植物冷冻干燥是一种常用的制备药材、干燥食品和细胞样品的方法。
在这个过程中，植物细胞内的水被冰冻住，然后将压缩空气用于加速水分的转移和干燥，最终得到具有长期储存稳定性的干燥样品。
然而，对于某些植物而言，在冷冻干燥过程中如何保持单糖稳定性却是一个比较棘手的问题。
单糖是细胞内非常重要的生物分子之一，除了在能量代谢中起到重要作用外，还参与了植物生长、维持组织结构和细胞信号转导等多个方面。
因此，在植物冷冻干燥过程中，单糖的转运和稳定性是至关重要的。
在冷冻干燥前，植物细胞内的单糖主要以游离状态存在，或者与其他分子形成缔合态。
这些单糖分子可自由扩散，被细胞吸收并利用。
然而，在冷冻干燥过程中，水分子被冰冻住，因此单糖分子无法自由扩散，转运出细胞。
为了克服这个困境，科学家们发展出了多种方法，如细胞通透剂，压缩和退冻等，来影响细胞内的单糖稳定性和转运。
其中最为普遍的方法是使用细胞通透剂，如蔗糖、甘油等。
这些分子在水结冰时，可以降低固形物浓度并缩小结冰晶体的大小，从而减少水分的流失和单糖分子对结晶的损害。
此外，这些通透剂还可以保持细胞内膜的完整性，降低单糖分子泄漏的风险。
另一个很关键的因素是压缩和退冻过程的控制。
在压缩期间，空气的流量、压力和温度等参数都需要精确地控制，以确保水分分子和单糖分子能够均匀地流动和扩散到干燥区域。
而在退冻期间，则需要缓慢而稳定地回升温度，以防止结晶破坏细胞内的单糖、蛋白质及其他分子。
通过这些方法，植物冷冻干燥过程中转移和稳定单糖能力得到了显著提高。
然而，不同植物和不同部位的细胞还有特定的单糖组成和转运机制，科学家们仍在继续针对性地优化冷冻干燥过程和条件。
对于一些特殊的单糖，如低聚果糖和低聚半乳糖等，在冷冻干燥过程中的转运和稳定性更是需要进一步研究。
总之，植物冷冻干燥过程中单糖的转运和稳定性对于细胞的完整性和样品质量都有重要影响。
通过更加精确的控制和优化，我们可以提高单糖和其他生物分子的保存稳定性，为制备更加高质量的药材、食品和细胞样品带来更大的便利。
蛋白药物冻干工艺研究汇要点
一、冷冻干燥过程研究真空冷冻干燥是先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气。
再用真空系统的冷凝器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。
该过程主要可分为：制品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五个步骤。
1 产品预冻1.1 制品的玻璃化玻璃化的作用。
近年来，人们已经逐渐地认识到，凡是成功的低温保存，细胞内的水均以玻璃态的形式被固化，在胞内不出现晶态的冰。
玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。
玻璃化的获得。
在产品预冻时，只要降温速率足够快，且达到足够低的温度，大部分材料都能从液体过冷到玻璃态固体。
“足够快”的意思是在降温过程中迅速通过结晶区而不发生晶化，“足够低”指的是必须把温度降到玻璃化转变温度Tg以下。
对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。
第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的玻璃化。
此法又称“部分玻璃化法”。
当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。
溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线(Ta)与玻璃化转变曲线(Tg)的交点(D点)时，溶液中剩余的水分将不再结晶(称为不可冻水)，此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。
1.2降温速率与预冻温度预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分钟降温1℃左右。
药物冷冻干燥技术的应用及其影响因素
影响冻干制品质量的因素
处方因素 （主要因素） 贮存条件 冷冻干燥 过程
因素
冻干品复水 化过程
处方组成的影响（主要为冻干保护剂）
冻干保护剂种类 代表药物
单糖（葡萄糖），多糖（海藻糖） 糖类 ，寡糖糖 醇类 甘露醇，山梨醇等 氨基酸 赖氨酸，甘氨酸 表面活性剂 聚乙烯吡咯酮，聚乙烯醇 蛋白质 血清白蛋白 多种保护剂合用 果聚糖或羟乙基淀粉与葡萄糖合用 slogan
聚乙烯吡咯酮 聚乙烯醇
PVP
PVA
PVP是一种多聚体,它对生物体或 生物大分子具有非特异性保护作 用;同时它也是一种非渗透性保 护剂,在细胞冻干保存中常与糖 类一起,主要通过与糖类间的氢 键作用和改变糖类的玻璃化温度 发挥作用,不同浓度和不同分子 量的PVP的作用不一样。
PVA是在冻干中常用的一种稳定 剂。它可以使纳米粒子的粒径 和多分散系数在冻干前后不发 生变化。PVA的分子碎片可以与 纳米粒子表面结合，且在多次 洗涤中也很难脱落，而这些包 裹在粒子表面的聚合物层既可 以稳定纳米粒，又可以提高后 者在冷冻过程中的稳定性。
冻干保护剂：糖类
以下为常见的糖类代表保护剂:
以葡萄糖为例，葡萄糖在脂质体冻干 中是一种较好的保护剂，但若单独使 用，冻干产品的药物渗漏往往比较严 重。
单糖
单糖
二糖
常用的有海藻糖、麦芽糖、乳糖。若在 冻干前分别在脂质体的内、外水相中加 入，则冻干品复水后药物的保留率较高。
二糖
寡聚糖
寡聚糖
单用时会引起一定程度的脂质体聚集 和融合。所以一般都会选择与其他保 护剂合用。
从此，冻干技术迅速兴起!!!
冷冻干燥法的定义是什么？
冷冻干燥（freeze drying lyophilization）
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糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制【关键词】蛋白质摘要论述了冷冻干燥过程对蛋白质药品的损伤及糖类在此过程中的保护作用机制,并分析了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、葡聚糖等几种糖作为保护剂的功能特点。
关键词糖;冷冻干燥;蛋白质;保护剂1 冷冻干燥的损伤作用冷冻干燥的实质是物质(水蒸汽)和能量的转换传递〔3〕。
生物材料在冻干时,必须经历水变成冰的冻结过程。
这是一个物理学的状态变化,同时还伴随着化学变化。
这些变化,将使受冻结的生物材料受到影响〔4〕。
蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。
预冻过程中水结冰时体积增大,致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏,从而使活性损失;另外,水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化,导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。
在第一阶段升华干燥时90 %以上的水分被升华除去。
第二阶段再干燥主要是除去药品中的残留水分。
残留水分过多,生化活性物质容易失活,大大降低了稳定性。
Thomas〔5〕报道,残留水分的水平对冻干物质的是否产生非定形的结晶相当重要。
控制冻干药品中的残留水分,关键在于第二阶段再干燥的控制。
因此在实际操作中,应该在保证药品活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第二阶段再干燥,真空度的控制尽可能提高,有利于残留水分的逸出。
但冻干品的水分并不是越低越好〔6〕。
因为每种蛋白质药品都含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定,过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。
另外,Shan 〔7〕的研究表明残留水分对蛋白质活力的回复影响最大。
0..除此之外,在冷冻贮藏中,由于冰晶与蛋白质的水合水的相互作用,使冰晶接近蛋白质的水合层,形成格子构造,水合层的水分子向冰晶的方向移动,产生脱水合现象,使蛋白质的水合构造遭到破坏〔8~10〕。
因而使蛋白质的高级结构发生改变,蛋白质的生理功能受到影响。
关于冷冻干燥对蛋白质的变性机理目前普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。
Dean〔11〕认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下,蛋白质将失去活性;而脱水过程本身能使蛋白质损伤,从而使复水后的蛋白质失去活性。
许多学者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子,在降温过程中,蛋白质分子周围的水分子不断冻结,但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结,则蛋白质就不会变性;反之,蛋白质就会变性。
Hanafusa 〔12〕利用在冷冻干燥过程中把卵清蛋白(ovalbumin)和肌球蛋白(myosin)进行了冷冻干燥对比实验,表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子,才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用。
当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时,蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。
同样,在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。
因此,在冷冻干燥蛋白质药物的过程中,一般要加入保护剂,防止由于蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。
2 糖的保护作用机理关于糖生物保护作用的机理,仍在研究和探讨之中。
目前主要有两种。
第一,认为由于蛋白质分子中存在大量氢键,结合水通过氢键与蛋白质分子联结。
当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后,蛋白的主相变温度会升高。
但某些糖的羟基能替代蛋白表面的水的羟基,使得蛋白的主相变温度变化不大,低于操作温度,从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。
即在冻干过程中,由于糖类属于亲水性物质,形成氢键能力较强,在氢键形成中即可以作为孤对电子的受体,又可以作为供体,因此,在蛋白质冻干过程中糖的羟基可与蛋白质中的极性基团形成氢键,从而代替蛋白质极性基团周围的水分子,使蛋白质表面形成一层假定的水化膜,这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中,稳定蛋白质的高级结构,防止蛋白质因冻干而变性,使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下,仍保持蛋白质结构与功能的完整性〔13~14〕。
这是“水替代假说”。
许多研究者赞成这种观点。
首先能够直接测量冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键〔15〕,从而显示出蔗糖对蛋白质的保护作用;其次,Dean〔11〕等在分别研究蔗糖、葡聚糖、蔗糖与葡聚糖的混合物对冷冻干燥过程中蛋白质的保护作用时发现,保护剂是否具有保护作用,关键在于保护剂在蛋白质脱水后能否与氢键结合。
一些研究者曾用傅立叶变换红外光谱分析法研究了海藻糖对大肠杆菌DH5α和苏云金杆菌HD-1冻干后蛋白质结构的作用,表明:不加海藻糖时,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰从水化细胞的1543 cm-1移至1533 cm-1;添加海藻糖后,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰的位置没有改变〔16〕。
从而证实,海藻糖作为保护剂在冻干过程中对蛋白质结构具有保护作用,也为“水替代假说”提供了证据。
第二,认为在含糖溶液的干燥过程中,当浓度足够大且糖的结晶不会发生时,糖-水混合物就会玻璃化,这时糖所处的状态称为玻璃态。
研究表明,单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行为,只是玻璃化转变温度不同而已。
由于某些糖的玻璃化温度较高,在较高的保存温度下,仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。
而在玻璃态下,物质兼有固体和流体的行为,粘度极高,不容易形成结晶;且分子扩散系数很低,因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围,形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体,使大分子物质的链锻运动受阻,阻止蛋白质的伸展和沉淀,维持蛋白质分子三维结构的稳定,从而起到保护作用,这是“玻璃态假说”〔17~18〕。
总之,生物活性物质保护剂要有较高的玻璃态温度,或者有一定量的羟基来替代水,使蛋白保持较低的主相变温度。
一般说来,如工作温度低于保护剂的玻璃化温度,高于被保护的活性物质的主相变温度,那么该活性物质就能有效地保持活性。
但在目前,这两种假说还不能完全解释现有的实验现象,所以对其保护的作用机理仍需深入研究。
3 几种糖的保护作用分析作为保护剂的糖类,其保护作用与它们的化学结构有密切关系。
它们通常具有5个以上的羟基,可以与蛋白质形成氢键以取代水,保证了蛋白质的稳定性;在溶液中它们易结合水分子,发生水合作用,减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性,从而减缓晶核的生长过程,使形成的冰晶较细小,以达到保护的目的。
常用作保护剂的糖类单糖主要有葡萄糖,双糖有蔗糖、海藻糖、乳糖,聚糖有葡聚糖。
它们有一个共同的特点就是具有大量的自由羟基,其中,葡萄糖、乳糖具有还原性,而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。
Saez〔19〕等研究表明,在-45℃时添加蔗糖、葡萄糖等保护剂对保持物质的活性是必需的,而且20%的浓度其保护效果最佳。
杨小明〔20〕在比较不同温度下葡萄糖、蔗糖、海藻糖和葡聚糖对纤维素酶的酶热稳定性的影响时发现,在20℃下蔗糖和葡萄糖对纤维素酶都有保护作用。
在高温下两种糖都破坏了纤维素酶的稳定性。
根据“水替代学说”,在比较低的温度下,可能是葡萄糖的羟基代替水分子同蛋白质表面分子作用,可以防止蛋白质因失水而引起的主相变温度的升高,减缓酶在存放过程中失活。
在高温下,由于葡萄糖是还原性糖,它的羟基会同蛋白质活性部位的氨基酸残基反应,使酶变性失活;而蔗糖在高温下很难形成玻璃态,起不到保护作用。
Mouradian也认为还原性保护糖的醛基能与蛋白质的伯氨基发生非酶性棕色反应,从而影响蛋白质的功能。
糖的还原性越弱,对冻干生物分子的贮存稳定性越强〔21〕。
Kai等研究发现,作为冷冻干燥保护剂,蔗糖在肽核酸再水化过程中对保持粒子大小证明是最有效的。
他认为蔗糖主要是作为填充剂对粒子赋型,另外,它的空间位阻效应也使之更能有效地进行冷冻保护〔22〕。
海藻糖是一种稳定的非还原性双糖。
与葡萄糖及蔗糖一样,海藻糖的羟基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分结合,对蛋白质形成保护。
同时海藻糖的分子较小,易于以分子的形式填充到蛋白质分子的空隙中,有效限制蛋白质分子内部的结构发生变化。
从而能避免变性失活。
值得注意的是虽然海藻糖与蔗糖都是二糖,水化能力也基本相同,但海藻糖的保护作用却远高于蔗糖。
这可能是因为它们的理化性质的差异所致。
可能由于海藻糖有较高的玻璃化温度,较易形成玻璃态,将蛋白质分子支撑和包裹起来,使之不易变性。
1987年,Leopld 和Vertucci提出一种想法来解释蔗糖和海藻糖保护效果的差异,他们指出因为蔗糖比海藻糖具有更容易形成结晶的趋势。
可以推想,蔗糖的结晶状态是不易与其它物质发生作用的〔2 3〕。
葡聚糖具有保护作用是因其有较高的玻璃化温度,能在酶蛋白分子的周围形成玻璃态,从而保护酶分子免受高温所引起的损伤。
但葡聚糖和蛋白质均为大分子,葡聚糖分子不容易进入蛋白质分子的空隙中,干燥后葡聚糖仅在蛋白质分子周围形成玻璃态的保护外壳。
处于壳内的蛋白质分子可以作一定限度的空间结构的变化,引起部分失活。
而在高温下,葡聚糖与蛋白质分子之间混合作用增大,有部分葡聚糖分子在蛋白质分子内部形成玻璃态,从而更有效地限制蛋白质分子空间结构发生变化。
4 问题目前,蛋白质的冻干技术还不够成熟,冷冻干燥引起蛋白质变性的机理还不完全清楚,对玻璃化、去玻璃化和结晶规律了解甚微,糖的保护作用机理仍在探讨之中,冷冻过程中降温速率对溶液的结晶及玻璃化程度的影响复杂,而它的选择似乎与保护剂的浓度有关。
同时,以玻璃态存在的保护剂呈现出复杂的特性,不同保护剂之间的组合保护特性等都需要进一步研究。
因此,应在已有的研究基础上,大力开展冷冻干燥对蛋白质变性机理的研究,并建立传热、传质的数学模型;研究不同的保护剂的保护作用;优化干燥工艺,提高冻干品的质量。
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