考马斯亮蓝染色法
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
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洗涤
用洗涤液洗涤染色后的蛋白质样品，去除多余的 染料。
测量
使用分光光度计测量蛋白质样品的吸光度值。
3
结果计算
根据标准曲线和吸光度值计算蛋白质含量。
04
结果分析
数据记录与整理
数据记录
在实验过程中，应详细记录每个实验 组的吸光度值，包括空白对照组。
数据整理
将实验数据整理成表格，包括实验组 别、吸光度值以及相应的波长等。
VS
药物研发
在药物研发过程中，考马斯亮蓝染色法可 用于评估药物对蛋白质表达的影响，为新 药研发提供实验依据。
未来发展方向与挑战
技术优化
随着科学技术的不断发展，考马斯亮蓝染色法需要不断优化和完善， 以提高检测的灵敏度和特异性。
应用领域拓展
随着蛋白质组学研究的深入，考马斯亮蓝染色法的应用领域将进一 步拓展，为生命科学和医学研究提供更多支持。
蓝色与黄色
考马斯亮蓝染色后呈蓝色，与未结合蛋白质的黄色形成鲜明对比，便于观察和 检测。
颜色深浅与浓度正相关
随着蛋白质浓度的增加，染色后样品的颜色逐渐加深，通过比色法可测定出不 同浓度下的光密度值，进而计算出蛋白质浓度。
03
实验步骤
样品准备
样品收集
蛋白质提取
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
05
应用与展望
在生物学领域的应用
蛋白质表达分析
考马斯亮蓝染色法常用于检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，有助于研究生物体的生 理和病理过程。
蛋白质分离与鉴定
通过考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色，可以方便地对蛋白质进行分离和鉴定，为蛋 白质组学研究提供技术支持。
在医学领域的应用
考马斯亮蓝染色总结
考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色是一种广泛应用于生物学实验中的染色技术，它可以用于检测许多不同的分子和细胞类型。
这种染色方法是法国生物学家Louis-Charles Malassez于1867年发明的，后由德国生物学家Richard Kuhn于1933年进行改良，使其成为现代生物学实验的标准技术之一。
本文将对考马斯亮蓝染色的方法、应用以及优缺点进行总结。
一、方法考马斯亮蓝染色的原理是，亮蓝染料可以与DNA的碱基对结合而形成复合物。
这种染色技术需要一些基本试剂，包括亮蓝染料、甲醛、醋酸以及石蜡等。
具体操作步骤如下：1. 取需要染色的细胞或组织样本，用生理盐水进行清洗；2. 将样本固定在载玻片上，用甲醛和醋酸进行固定处理；3. 将载玻片在70％乙醇和95％乙醇中依次浸泡，以去除固定剂；4. 在50％和75％醇溶液中浸泡数分钟，使样本逐渐变暗；5. 用亮蓝染料染色，通常需要在100倍和400倍低倍镜下观察。
二、应用考马斯亮蓝染色可以用于检测DNA、RNA、核蛋白和细胞质等细胞成分。
在分子生物学实验中，考马斯亮蓝染色被广泛应用于检测DNA条带的大小、纯度和含量。
此外，它还可以用于细胞形态和结构的观察，如观察细胞核、染色质和核仁等。
在医学领域中，考马斯亮蓝染色可以用于检测肿瘤、癌细胞、炎症细胞和血液样本等。
从组织样本中提取DNA或RNA 时，也会使用该染色技术。
三、优缺点优点：1.对许多不同类型的细胞和分子具有高度灵敏度和特异性。
2.操作简便，仅需要一些基本试剂和设备。
3.观察结果清晰，可以展示细胞组织的形态和结构。
4.染色技术稳定性好，结果可复制性高。
缺点：1.过程中可能会使样本遭到破坏或溶解。
2.亮蓝染料可能与背景杂质结合，导致结果不准确。
3.需要专业人员进行染色和观察，较为复杂。
4.染色后，样品无法再进行分子生物学的使用，比如PCR 反应等。
结语：考马斯亮蓝染色是一种简便、灵敏并且重要的分子生物学实验技术。
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法是一种通过观察物体的颜色变化来判断其性质的方法。
这种方法基于考马斯的色彩理论，将特定颜色下的物体辨识和观察融为一体。
该方法的原理是通过改变物体所反射或发射的光的波长和强度，使其显示出不同的颜色。
根据物体的性质，通过对照表或经验判断，可以了解物体的组成或特性。
考马斯亮蓝法主要应用于无机化学实验中。
实验者通过加入特定试剂，使物质发生化学反应或形成络合物，从而改变物质的颜色。
通过观察颜色的变化，可以判断原物质或化学物质的存在与数量。
这种方法通常具有一定的选择性和灵敏性，能够检测出一些微量物质，甚至在样品中的稀有金属等特定成分。
需要注意的是，考马斯亮蓝法虽然可以提供一种快速和经济的分析方法，但仍然需要经验和专业知识的支持。
对于某些复杂的样品或分析目标，可能需要进行更为精确的分析和检测。
因此，在实际应用中，需要综合考虑多种方法，以提高分析的准确性和可靠性。
可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法)
可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）
1.试剂配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇37.5ml，75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
（2）100 μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA,用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容至100 ml即为100 μg/ml。
2. 标准曲线绘制
取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3. 样品测定
（1）样品提取：取鲜样2g，加2ml蒸馏水研磨成匀浆后，移到离心管中，然后用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，完全转移至离心管后，放置0.5-1小时以充分提取，然后4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转移至容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，待测。
（2）吸取样品提取液 1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入带塞试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min待反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
4. 蛋白质含量计算
可溶性蛋白含量（mg/g）=(C·V T)/（1000V S·W F）
C—查标准曲线值，μg；
V T—提取液总体积，ml；
W F—样品鲜重，g；
V S—测定时加样量，ml。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法
原理
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
配制
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
注意事项
1.在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
2.测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
3.利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
bradford法
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30 分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋→紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100µg
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷
灵敏度高 ～5µg
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5µg
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 λ max 由 465nm 变为595nm
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 ±2％ 灵敏度低 1～20mg 费时 8～10小 时 将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离） 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
2、缺点 、
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝染色法原理
考马斯亮蓝染色法原理考马斯亮蓝染色法是一种常用于病理学实验室的染色技术，主要用于肿瘤组织的诊断和研究。
该染色法的原理是利用某些化学物质的亲和性，将细胞或组织中的特定结构染色，从而能够观察到细胞和组织的形态特征，进而进行病理学分析。
考马斯亮蓝染色法的原理主要涉及到两个方面，即亲和性和染色效应。
首先是亲和性，考马斯亮蓝染色法使用的考马斯亮蓝染料具有与DNA分子特异性结合的能力。
DNA在细胞核中起着存储遗传信息的作用，而考马斯亮蓝染料能够与DNA分子中的负电荷结合，形成染色复合物。
这种亲和性使得考马斯亮蓝染料能够选择性地染色细胞核。
其次是染色效应，考马斯亮蓝染色法使用的考马斯亮蓝染料在细胞核中形成的染色复合物呈现出蓝色。
这是因为考马斯亮蓝染料分子中含有苯环结构，该结构能够吸收可见光中的蓝色波长，使得染色复合物呈现蓝色。
而其他组织结构或细胞器中的成分不具备与考马斯亮蓝染料结合的亲和性，因此不会被染色。
考马斯亮蓝染色法的操作步骤相对简单。
首先，需要将待染的组织切片置于玻片上，并进行固定和脱水处理。
接下来，将考马斯亮蓝染料溶液滴在组织切片上，使其与细胞核结合形成染色复合物。
然后，将组织切片在显微镜下观察并进行分析。
考马斯亮蓝染色法的应用广泛，特别是在肿瘤学领域。
通过使用该染色法，可以观察肿瘤细胞的形态特征，如细胞核形态、大小、核仁的形成情况等。
此外，还可以通过对组织切片的染色程度进行评估，从而判断肿瘤的恶性程度。
考马斯亮蓝染色法还可以用于研究细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学过程。
考马斯亮蓝染色法是一种常用的病理学染色技术，通过特定化学物质与细胞核中的DNA结合形成染色复合物，从而实现对细胞和组织的染色。
该染色法的原理清晰，操作简单，具有广泛的应用前景。
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蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
二、标准和待测蛋白质溶液
1．标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
2．未知蛋白质溶液。
三、器材
试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、标准法制定标准曲线
取14支试管，分两组按下表a平行操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
表b
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
三、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。
注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题：
根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：（1）样品不易溶解，但要求结果较准确。
（2）要求在半天内测定60个样品。
（3）要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。