一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法_江南
实验二考马斯亮蓝G-250染 料结合法测定蛋白质含量
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分 迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制 简单，操作简便快捷，反应非常灵敏， 可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质 浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常 用的微量蛋白质快速测定方法。
实验二 考马斯亮蓝G-250染 料结合法测定蛋白质含量
一 实验目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定 蛋白质含量的原理和方法。
分光光度计在比色法中的应用。
二 实验原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法 的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下 呈红色，最大光吸收波长λ=488nm。
六 实验结果及数据处理
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg） 注意/（1）蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分 迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将 使测定结果偏低。 （2）测定时使用玻璃比色杯，测完后立即用95%乙醇洗 涤器与试剂
主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）分光光度计
试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准 确称取10mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 00μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制： 称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于 50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷 酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。 此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％）
实验2 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
实验三蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）一、目的1.学习一种蛋白质染色测定的方法2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2～5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01～1.0 mg 蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDT A、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、器材与试剂1.仪器（1）分析天平；（2）具塞刻度试管10ml×8；（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研钵；（5）漏斗；（6）离心管10ml；（7）容量瓶10ml；（8）离心机；（9）721型分光光度计2.试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料植物种子四、操作步骤1.盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在l h内完成）。
以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2.样品中蛋白质含量的测定（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定至刻度。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定
实验二考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
bradford法名词解释
bradford法名词解释
Bradford法是一种快速简便的蛋白质浓度测定方法，由Bradford于1976年建立。
它是利用蛋白质与考马斯亮蓝G250结合后颜色变化大，最大吸收峰移至595nm，消光系数大等特性进行测定的。
具体实验步骤包括标准曲线的制作和样品检测，使用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光度。
此法的优点是灵敏度高、测定快速简便、干扰物质少，但用于不同蛋白质测定时偏差较大，且有一些物质干扰此法的测定。
它是目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一，广泛应用于生物检验领域。
实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法
制作标准曲线：
编号
1 (空白）
2
3 4 5 6 7 样品
标准蛋白 (ml)
0.0
水
0.5
(ml)
0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5ml
0.4 0.35 0.3 0.2 0.1 0.0
浓度 (mg/ml)
0.0
0.05 0.075 0.1 0. 15 0.2 0.25
实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染 色法
（3）紫外吸收法：
蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共 轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收 紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含 量成正比，可用作定量测定。
简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干 扰。
实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染 色法
度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。
同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异， 在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法 进行物质定量分析的重要依据。
I0：表示入射光强度，It ：表示光线通过溶液后的强度。
实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染 色法
A＝lg（I0/It)=-lgT＝εb c
实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染 色法
⑶吸收池
吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。 光学比色杯和石英比色杯两种。
光学比色杯适用波长范围是400nm～2000nm ，只能 用于可见光。
石英比色杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是 最 常 使 用 的 吸 收 池 ， 使 用 波 长 范 围 是 180nm ～ 3000nm。
（2）T—透光度：描述入射光透过溶液的程度； （3）ε—摩尔吸光系数(是溶液的特征常数)，在数值 上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在 某一波长下的吸光度；单位mol·L－1； （4）b—样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收 地，b=1cm （5）C—样品浓度（mol/L） 由上式可以看出：吸光度OD与物质的浓度“C”和溶 液吸光的厚度成正比。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到1 000 mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD，并做标准曲线。
595nm表1 低浓度标准曲线制作管号 1 2 3 4 5 61 000μg／mL标准蛋白液（mL）0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100 OD595（2）0~1 000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。
实验四 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
具塞刻度试管中，加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂，充分混合，放置 2min 后用 1cm 光
径比色杯在 595nm 下比色，记录光密度 OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白 质的含量 X（μg）。以标准曲线 1 号试管做空白。
表 1-2-3 待测液蛋白质浓度测定
管号
13
（2）0—1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取 6 支 10mL 具塞试管，按表 2-2 取样。其余步 骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为 0—1 000μg／mL 的标准曲线。
表 1-2-2 高浓度标准曲线制作
管号
7
8
9
10
11
12
1 000μg／mL 标准蛋白液（mL） 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
14
蛋白质待测样品提取液（mL）
0.1
0.1
蒸馏水（mL）
0.9
0.9
考马斯亮蓝 G-250 试剂（mL）
5
5
OD595nm 蛋白质含量（μ / g 鲜重）=
提取液总体积（mL） 测定时取样体积（mL） 样品鲜重（g）
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
移到离心管中，再用 6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置 0.5—1h
以充分提取，然后在 4 000r/min 离心 20min，弃去沉淀，上清液转入 10mL 容量瓶，并以蒸
馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取 2 支 10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液 0.1mL（做一重复），放入
蒸馏水（mL）
1.00 0.8 0.6 0.4 0.2
0
一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法_江南
经验交流一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法＊江 南1) 吴开力 黄 强 潘苏华(中山医科大学中山眼科中心,广州510060)摘要 介绍一种快速、简便、几乎无背景的考马斯亮蓝G250(CBB G250)染色方法.该方法所用试剂仅为稀盐酸和CBB G250,CBB G250的工作浓度为0.0015%,灵敏度达0.02μg/带,染色2h达70%,4h以上或染色过夜即可充分染色.与以往的考马斯亮蓝染色方法相比,该方法有经济方便、灵敏度高、几乎无背景等优点,便于推广应用.关键词 电泳,染色方法,考马斯亮蓝G250学科分类号 Q5-33 蛋白质电泳后染色方法有多种:氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和银染色等.其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低,和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点,是最常用的染色方法.但它仍然存在一些问题,如考马斯亮蓝R250 (CBB R250)背景深、耗时长;CBB G250灵敏度不高;二者所耗试剂均较多.近几年,人们对考马斯亮蓝染色法作了许多改进,不同程度地改善了某些方面的问题,但仍未尽善.本文介绍一种经济快速,灵敏度高,几乎无背景的CBB G250染色方法.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 蛋白质样品:牛血清白蛋白(BSA)购自Bio-Rad公司;小牛晶状体的alpha晶体蛋白由Sephadex G200sf两次柱层析(100cm×1.6cm和40cm×1.6cm)分离获得.1.1.2 染色液配制:1mol/L盐酸溶液(A), 1g/L CBB G250溶液(B);应用时用1ml A液和15ml B液混合加水至1L,搅拌混匀.1.1.3 仪器:Bio-Rad Model1000/500电泳仪; Bio-Rad(Mini-ProteanⅡ)电泳槽.DY-1500A型高压电泳仪;Pharmacia Bio tech(M ultiphorⅡ)电泳槽.1.2 方法1.2.1 电泳:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦(IEF)参照郭尧君等[1]方法操作.1.2.2 染色程序:a.电泳完毕,取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中,振荡1h;b.弃去盐酸溶液,重复步骤a;c.将胶置于染色液中,染色2～16h,连续振荡;d.弃去染色液,将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时(换液3～5次).最后对凝胶进行观察和照相,并将凝胶保存于1mmol/L盐酸溶液中.1.2.3 凝胶染色图象分析:在染色和漂洗过程中应用Alphaimage2000Documentation&Analysis System对凝胶照相(同一照相条件及参数)并作蛋白质条带染色强度分析;观察染色的强度变化时,以同一参照点分别测定蛋白质条带和凝胶背景的染色强度;测定漂洗时染色强度变化则以蛋白质条带的强度减去背景强度后作为该蛋白质条带的染色强度;染色强度和加样量的相关性分析采用Video DensitometerⅡSystem(USA Biomed Instrument.Inc),扫描每条蛋白质条带的染色强度并计算其与加样量的依存关系;染色的灵敏度通过加样不同浓度(≥10ng)的BSA,染色后以肉眼能观察到的最低浓度的条带为标准. ＊广东省自然科学基金项目(970084)部分工作. 1)通讯联系人. Tel:(020)87330395,E-mail:yunj uyan@ 收稿日期:1999-08-15,修回日期:2000-01-04·560·生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2000;27(5)2 结果与讨论2.1 染色与漂洗随时间的变化规律2.1.1 染色:BSA和小牛alpha晶体蛋白的变化规律相同.5～10min即显现蛋白质条带而可进行初步观察,2h染色达70%,4h后染色基本达到饱和,与24h染色的强度相近.2.1.2 漂洗:本法染色背景色不深,漂洗1.5～2 h达到完全脱去背景色,即可进行照相或图象分析.2.2 本染色方法的优点2.2.1 灵敏度高:一般CBB G250染色的灵敏度为2.0μg/带[2],Westermeier[3]介绍了一种高灵敏度的CBB G250染色法,其灵敏度为0.03μg/带.本方法则为0.02μg/带,灵敏度较一般CBB G250染色法明显提高,与Neuhoff等的方法接近,但远较其经济、简便和快速.表1 三种C BB G250染色法的比较一般C BB G250Westermeier介绍的CBB G250本文介绍的CBB G250灵敏度(μg/带)2.00.030.02总时间/h8～108～10≥6CBBG250浓度 /%0.250.10.0015背景浅几无背景几无背景所用试剂较多多少2.2.2 相关性好:本文使用凝胶厚度为1mm,通过测定alpha A(A)、alpha B(B)加样量1～14μg/带的染色强度与加样量的关系可见,染色强度与蛋白质加样量的相关性非常好(R2>0.99),能较为准确地反映蛋白质量的变化.2.2.3 近于无背景染色:CBB G250是一种生物染料,能选择性地与蛋白质和多肽结合.传统的CBB G250染色法中CBB G250浓度为0.25%,具有背景色低的特点,但仍有部分染料滞留于丙烯酰胺凝胶中,需一定时间脱色才能得到更清晰的背景.该方法所用CBB G250浓度仅为0.0015%,滞留于凝胶中的染料进一步减少,背景色浅,经2h 左右的漂洗脱色,几乎无背景残留.2.2.4 简便经济:除CBB G250外,一般CBB G250染色法所需试剂为甲醇、乙酸、三氯乙酸等,Westermeier介绍的高灵敏度染色法所用试剂有磷酸、过硫酸铵、Tris、三氯乙酸、甲醇和乙醇,操作步骤复杂.本文所介绍的方法仅需稀盐酸和CBB G250两种试剂,便宜易得,经济方便,不仅节省经费,也大大简化了配液和染色的步骤. 2.3 应用范围 初步观察本法用于SDS-PAGE和常规PAGE 的效果较好,而用于IEF凝胶染色效果较差.可能因为IEF凝胶的pH值不均一,影响染色效果;另外,IEF凝胶中含有尿素和两性载体,对染色效果可能也有影响,但要找出真正原因,需进一步研究.参 考 文 献1 郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京:科学出版社,1999.57～140Guo Y J.Experiment Tech nology of Protein El ectrophoresis.Beijing:Science Publishing Hous e,1999.57～1402 王太重,李 栋,樊秀华,等.PAGE一步性低背景CBB R250染色方法的探讨.湖北医科大学学报,1995,16(1):84～85Wang T Z,Li D,Fan X H,et a l.Acta Academiae M edicineHubei,1995,16(1):84～853 Westermeier R.Electrophores is in Practice.New York:VCH Publishers Inc.1993:181A Simple Method of Protein Staining with CBB G250.JIANG Nan,WU Kai-Li,HUANG Qiang,PAN Su-Hua(Zhongshan Ophthalm ic Center,Sun Yat-sen University of Medical Scienc es,Guangzhou510060,China).Abstract A simple method of protein staining w ith Coomassie Brilliant Blue G250is introduced,w hich had almost no backg round,needed less time and only two reagents.The w orking concentration of Coomassie Brilliant Blue G250in the staining sy stem w ith diluted hy drochloric acid w as0.0015%,and the sensitivity w as0.02μg pro tein per electrophoresis zone.Key words electropho resis,staining method, coomassie brilliant blue G250·561·2000;27(5) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.。
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经验交流
一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法*
江南1)吴开力黄强潘苏华
(中山医科大学中山眼科中心,广州510060)
摘要介绍一种快速、简便、几乎无背景的考马斯亮蓝G250(CBB G250)染色方法.该方法所用试剂仅为稀盐酸和CBB G250,CBB G250的工作浓度为010015%,灵敏度达0102L g/带,染色2h达70%,4h以上或染色过夜即可充分染色.与以往的考马斯亮蓝染色方法相比,该方法有经济方便、灵敏度高、几乎无背景等优点,便于推广应用.
关键词电泳,染色方法,考马斯亮蓝G250
学科分类号Q5-33
蛋白质电泳后染色方法有多种:氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和银染色等.其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低,和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点,是最常用的染色方法.但它仍然存在一些问题,如考马斯亮蓝R250 (CBB R250)背景深、耗时长;CBB G250灵敏度不高;二者所耗试剂均较多.近几年,人们对考马斯亮蓝染色法作了许多改进,不同程度地改善了某些方面的问题,但仍未尽善.本文介绍一种经济快速,灵敏度高,几乎无背景的CBB G250染色方法.
1材料和方法
111材料
11111蛋白质样品:牛血清白蛋白(BSA)购自Bio-Rad公司;小牛晶状体的alpha晶体蛋白由Sephadex G200sf两次柱层析(100cm@116cm和40cm@116cm)分离获得.
11112染色液配制:1mol/L盐酸溶液(A), 1g/L CBB G250溶液(B);应用时用1ml A液和15ml B液混合加水至1L,搅拌混匀.
11113仪器:Bio-Rad Model1000/500电泳仪; Bio-Rad(M in-i ProteanÒ)电泳槽.DY-1500A型高压电泳仪;Pharmacia Biotech(M ultiphorÒ)电泳槽.
112方法
11211电泳:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦(IEF)参照郭尧君等[1]方法操作.
11212染色程序:a1电泳完毕,取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中,振荡1h;b1弃去盐酸溶液,重复步骤a;c1将胶置于染色液中,染色2~ 16h,连续振荡;d1弃去染色液,将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时(换液3~5次).最后对凝胶进行观察和照相,并将凝胶保存于1mmol/L盐酸溶液中.
11213凝胶染色图象分析:在染色和漂洗过程中应用Alphaimag e2000Documentation&Analysis System对凝胶照相(同一照相条件及参数)并作蛋白质条带染色强度分析;观察染色的强度变化时,以同一参照点分别测定蛋白质条带和凝胶背景的染色强度;测定漂洗时染色强度变化则以蛋白质条带的强度减去背景强度后作为该蛋白质条带的染色强度;染色强度和加样量的相关性分析采用Video DensitometerÒSystem(USA Biomed Instrument.Inc),扫描每条蛋白质条带的染色强度并计算其与加样量的依存关系;染色的灵敏度通过加样不同浓度(\10ng)的BSA,染色后以肉眼能观察到的最低浓度的条带为标准.
*广东省自然科学基金项目(970084)部分工作.
1)通讯联系人.
Tel:(020)87330395,E-mail:yunj uyan@
收稿日期:1999-08-15,修回日期:2000-01-04
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#生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2000;27(5)
2结果与讨论
211染色与漂洗随时间的变化规律
21111染色:BSA和小牛alpha晶体蛋白的变化规律相同.5~10min即显现蛋白质条带而可进行初步观察,2h染色达70%,4h后染色基本达到饱和,与24h染色的强度相近.
21112漂洗:本法染色背景色不深,漂洗115~2 h达到完全脱去背景色,即可进行照相或图象分析.
212本染色方法的优点
21211灵敏度高:一般CBB G250染色的灵敏度为210L g/带[2],Westermeier[3]介绍了一种高灵敏度的CBB G250染色法,其灵敏度为0103L g/带.本方法则为0102L g/带,灵敏度较一般CBB G250染色法明显提高,与Neuhoff等的方法接近,但远较其经济、简便和快速.
表1三种C BB G250染色法的比较
一般CBB G250Westermeier介绍的
CBB G250
本文介绍的
CBB G250
灵敏度(L g/带)21001030102
总时间/h8~108~10\6
CBBG250浓度
/%0125011010015背景浅几无背景几无背景所用试剂较多多少
21212相关性好:本文使用凝胶厚度为1mm,通过测定alpha A(A)、alpha B(B)加样量1~ 14L g/带的染色强度与加样量的关系可见,染色强度与蛋白质加样量的相关性非常好(R2>0199),能较为准确地反映蛋白质量的变化.
21213近于无背景染色:CBB G250是一种生物染料,能选择性地与蛋白质和多肽结合.传统的CBB G250染色法中CBB G250浓度为0125%,具有背景色低的特点,但仍有部分染料滞留于丙烯酰胺凝胶中,需一定时间脱色才能得到更清晰的背景.该方法所用CBB G250浓度仅为010015%,滞留于凝胶中的染料进一步减少,背景色浅,经2h 左右的漂洗脱色,几乎无背景残留.
21214简便经济:除CBB G250外,一般CBB G250染色法所需试剂为甲醇、乙酸、三氯乙酸等,Westermeier介绍的高灵敏度染色法所用试剂有磷酸、过硫酸铵、Tris、三氯乙酸、甲醇和乙醇,操作步骤复杂.本文所介绍的方法仅需稀盐酸和CBB G250两种试剂,便宜易得,经济方便,不仅节省经费,也大大简化了配液和染色的步骤. 213应用范围
初步观察本法用于SDS-PAGE和常规PAGE 的效果较好,而用于IEF凝胶染色效果较差.可能因为IEF凝胶的pH值不均一,影响染色效果;另外,IEF凝胶中含有尿素和两性载体,对染色效果可能也有影响,但要找出真正原因,需进一步研究.
参考文献
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Guo Y J.Experiment Technology of Protein Electrophoresis.
Beijing:Science Publishing House,1999.57~140
2王太重,李栋,樊秀华,等.PAGE一步性低背景CBB R250染色方法的探讨.湖北医科大学学报,1995,16
(1):84~85
Wang T Z,Li D,Fan X H,et al.Acta Academ i ae M edicine Hubei,1995,16(1):84~85
3Wes termeier R.Electrophoresi s in Practice.New York:VCH Publishers Inc.1993:181
A Simple Method of Protein Staining with CB
B G250.JIANG Nan,WU Ka-i Li,H UANG Qiang,PAN Su-Hua(Zhongshan Op hthalm ic Center,Sun Yat-sen University o f Medical Sciences,Guangz hou510060,China).
Abstract A simple method of protein staining w ith Coomassie Brilliant Blue G250is introduced,w hich had almost no background,needed less time and only two reagents.The w orking concentration of Coomassie Brilliant Blue G250in the staining system w ith diluted hy drochloric acid w as010015%,and the sensitivity w as0102L g protein per electrophoresis zone.
Key words electrophoresis,staining method, coomassie brilliant blue G250
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2000;27(5)生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.。