质粒复制的调控机制
质粒复制过程
质粒复制过程质粒复制是指质粒在细胞中自我复制的过程。
质粒是一种环状的DNA分子，存在于原核生物和真核生物中的细胞质中。
质粒复制的过程是细胞分裂前的一个重要步骤，它确保了每个新细胞都能得到完整的质粒。
在质粒复制过程中，首先需发生DNA解旋，即双链质粒DNA被解开，形成两条单链DNA模板。
接着，DNA复制酶（DNA polymerase）结合到单链DNA模板上，并开始合成新的DNA链。
DNA复制酶在模板上依次添加互补碱基，与单链DNA形成新的双链DNA。
这个过程称为DNA合成。
质粒复制还需要一个起始位点，称为复制起始位点（origin of replication），它是质粒DNA复制的起点。
复制起始位点通常是一段特定的序列，其中有一些特殊的结构元件。
在这些结构元件的作用下，复制酶能够结合到起始位点，并开始质粒复制。
在复制过程中，质粒的两个复制叉（replication fork）会迅速朝两个相反方向移动，直到质粒的整个DNA分子被复制完成。
每个复制叉上的DNA合成是连续进行的，但两个复制叉之间的DNA合成是间断的。
这是因为DNA合成酶只能在5'到3'方向上合成新的DNA链，而质粒复制两个复制叉的方向是相反的。
质粒复制的终止是通过特定的终止序列来实现的。
一旦复制酶遇到终止序列，它会停止合成新的DNA链，并解离质粒。
此时，两个复制叉上的DNA链会被连接在一起，形成完整的质粒DNA分子。
质粒复制是一种高度调控的过程。
细胞中存在一系列的调控因子，它们能够控制质粒复制的起始、速率和终止。
这些调控因子的作用保证了质粒复制的准确性和稳定性，以确保每个新细胞都能得到完整的质粒。
质粒复制的研究对于理解细胞遗传学、基因工程和抗生素抗性的形成机制都具有重要意义。
表达型质粒的特点
表达型质粒的特点
表达型质粒的特点主要包括以下几个方面：
1. 复制能力：表达型质粒能够在宿主细胞内自主复制，并且保持稳定的复制能力，保证质粒的扩增和遗传稳定性。
2. 基因表达：表达型质粒可以携带外源基因，并在宿主细胞内表达这些基因，实现基因的异源表达。
3. 调控机制：表达型质粒通常具有可调节的启动子和终止子，可以对外源基因的表达进行调控，如通过添加特定的诱导剂或调节温度等手段来控制基因的表达。
4. 安全性：表达型质粒应具有良好的安全性，不应引起宿主细胞的毒性和免疫反应。
5. 可操作性：表达型质粒应易于操作和转化，能够实现高效的转化效率，以便于基因工程的实验和应用。
总之，表达型质粒是一种在基因工程中常用的载体，它能够实现外源基因的稳定表达和有效调控，为基因工程的研究和应用提供了重要的工具。
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体是一种病毒，它感染细菌并利用细菌的机制进行自我复制。
质粒则是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子。
下面是噬菌体和质粒DNA的复制方式。
噬菌体的复制方式：
1. 吸附：噬菌体通过尾部特异性地吸附到宿主细胞的表面。
2. 侵入：噬菌体的尾部通过酶的作用切开宿主细胞的外膜，注入内部的DNA。
3. 复制：噬菌体的DNA进入宿主细胞的核，利用宿主细胞的机制进行DNA复制。
首先，噬菌体的DNA作为模板，利用宿主细胞的酶和能量进行复制，产生新的噬菌体DNA。
然后，这些新的DNA与蛋白质外壳组装，形成新的噬菌体颗粒。
4. 成熟与释放：最后，成熟的噬菌体颗粒通过宿主细胞的裂解被释放出来，进行下一次的感染。
质粒DNA的复制方式：
1. 自我复制：质粒DNA可以在宿主细胞内进行自我复制。
质粒DNA的复制依赖于宿主细胞的机制，包括使用宿主细胞的DNA聚合酶进行复制，以及利用宿主细胞的能量进行ATP合成等。
2. 分配：在宿主细胞分裂时，质粒DNA会被平均分配给两个子细胞。
质粒DNA 的复制和分配是受调控的，以确保其在宿主细胞内的稳定遗传。
无论是噬菌体还是质粒，它们在复制过程中都受到各种因素的调控，以确保其稳定性和适应性。
这些过程涉及许多生物化学反应和结构变化，为深入理解这些过程需要研究更多的科学细节。
质粒
pMB1
15-20
pUC系列质粒
pMB1
500-700
pACYC及其衍生质粒
p15A
10-12
pSC101及其衍生质粒
pSC101
∽5
ColE1
ColE1
15-20
1. 质粒复制的方式
质粒的复制主要是通过θ型复 制和滚环复制两种方式之一进 行的，其中以θ型复制为主。 在θ型复制中，有单向复制和 双向复制两种类型。
R100
产生抗生素或细菌素的质粒
产生毒素的质粒
降解质粒
水扬酸盐
萘
乙醛 丙酮酸盐
致病性质粒
Opines:冠樱碱 Octopine（章鱼碱） Nopaline（胭脂碱）
共生固氮质粒 隐蔽质粒
第三节 质粒的检测
一、质粒的消除
1. 理化因子消除法 质粒消除有两种作用机制： a. 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，从而在 细菌生长繁殖过程中逐步淘汰 b. 选择性抑制带有质粒的菌的生长
革兰氏阴性细菌中多数质粒是 以θ型方式复制，R1、R100等 是单向复制，F、R6k等是双 向复制类型。
在革兰氏阳性细菌 中大多数质粒是以 滚环方式复制。
2. 复制起点(ori)区的功能
复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在 其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、 参与DNA合成起始调控因子的结合位点。
2. 原生质体诱导的质粒消除
第三节 质粒的检测
二、遗传转移 三、分子杂交 四、质粒的分离、检测与纯化
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心 3. 电镜观察
第四节 质粒的复制和调节
一、 质粒的大小和拷贝数
1. 质粒大小的测定 与标准质粒电泳比较，酶切分析，电镜照片推算，序列 分析。
温度敏感型的质粒复制系统及其应用
温度敏感型的质粒复制系统及其应用质粒是一种在细菌和一些真核生物中存在的外源性圆形DNA分子，它可以在细胞内自主复制和表达。
质粒通常携带一些对细胞有益或有害的基因，如抗生素抗性基因、毒素基因、代谢基因等。
质粒在生物技术中有着广泛的应用，如基因克隆、基因编辑、重组蛋白表达、基因治疗等。
质粒复制是指质粒在细胞内以特定的频率和拷贝数进行DNA复制的过程。
质粒复制受到多种因素的调控，如质粒起始复制位点（ori）、复制蛋白（Rep）、拷贝数控制机制（ccm）等。
不同类型的质粒有不同的复制方式和特点，如高拷贝数的pUC系列质粒、低拷贝数的pSC101系列质粒、温度敏感型的pSC101 ori/Rep101(Ts)系统等。
质粒复制对细胞的影响和限制主要有两方面：一方面，质粒复制会消耗细胞的能量和资源，增加细胞的代谢压力和不稳定性，影响细胞的生长和分裂；另一方面，质粒复制会导致目标基因的过度表达或沉默，干扰细胞的正常功能和信号传导，引起细胞的毒性或耐受性。
为了解决这些问题，研究人员开发了一种温度敏感型的质粒复制系统，它可以利用温度变化来控制质粒的复制和表达。
这种系统具有以下优势和创新点：•它可以在低温下实现高效的质粒转化和目标基因表达，在高温下实现快速的质粒消除和目标基因沉默；•它可以避免使用抗生素或其他化学物质来筛选或诱导质粒，减少对细胞和环境的污染和伤害；•它可以提高质粒稳定性和可重复性，降低实验成本和难度；•它可以扩展质粒应用范围和灵活性，适用于多种实验目的和条件。
pSC101 ori和Rep101(Ts)的结构和特性pSC101 ori是一种低拷贝数的质粒起始复制位点，它来自沙门氏菌的pSC101质粒。
pSC101 ori的序列长度为1.2 kb，包含了两个重要的元件：一个是RepA蛋白的编码基因repA，另一个是RepA蛋白结合的位点iteron 。
RepA蛋白是pSC101 ori复制所必需的唯一蛋白，它可以识别并结合到iteron 上，从而启动质粒的双链开裂和单链延伸。
质粒的生物学
也发现有线型双链DNA质粒和 质粒和RNA质粒； 质粒； 也发现有线型双链 质粒和 质粒 疏螺旋体、 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
质粒的检测
t 提取所有胞内 提取所有胞内DNA后电镜观察； 后电镜观察； 后电镜观察 t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察； 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察； 通常用碱裂解法提取质粒
质粒的命名
个字母(小写 第1个字母 小写 ： p， 质粒（plasmid）; 个字母 小写)： ， 质粒（ ） ）：人名 第2，3 个字母（大写）：人名，实验室名，表型 ， 个字母（大写）：人名，实验室名， 性状或其他特征的英文缩写; 性状或其他特征的英文缩写 编号（阿拉伯数字） 编号（阿拉伯数字） ：区别同一类型的不同质粒 例： pUC18, pUC19
质粒的复制
(replicon)是一个复制单位 细菌染色体是一个复制子， 是一个复制单位， 复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子， 每一个质粒也是一个复制子。 每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的 位点。 部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点, 部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点,即ori位点 大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。 大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。 oriC oriV 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的， 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的， 其中以θ型复制为主。 型复制中， 其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向复制和双向复制两 种类型， R1、R100等的复制是单向的 等的复制是单向的， R6k是双向复制 种类型，如R1、R100等的复制是单向的，而F和R6k是双向复制 类型。 类型。
质粒复制的调控机制
稳定性
质粒复制多样性可能导致质粒在宿主细胞内的 稳定性降低，增加丢失的风险。
传播性
质粒复制多样性有助于质粒在不同宿主细胞间的传播，扩大影响范围。
质粒复制多样性的应用和前景
生物工程领域
利用质粒复制多样性，设计新型质粒载体，提高基因工程 的效率和安全性。
01
医学领域
研究质粒复制多样性对病原菌的传播和 致病性的影响，为疾病防治提供新思路。
生长条件
宿主细胞的生长条件如营养物质 、氧气的供应等也会影响复制速 率。
复制终止的调控
终止序列
质粒复制终止区（Ter）通常包含特定的DNA序列， 能够与复制蛋白相互作用，诱导复制终止。
拓扑异构酶
拓扑异构酶能够改变DNA的拓扑结构，影响复制 的终止。
蛋白质因子
某些蛋白质因子能够与Ter序列结合，抑制复制的 继续进行，诱导复制终止。
从而影响宿主细胞的生存。
宿主细胞对质粒复制的调控
复制起始调控
宿主细胞通过调控质粒复制的起 始来控制质粒的数量，确保质粒 复制与宿主细胞的生长和分裂相 协调。
复制终止机制
宿主细胞还具有调控质粒复制终 止的机制，以防止质粒过度复制 和不稳定性的产生。
复制速度的调节
宿主细胞还通过调节质粒复制的 速度来维持质粒的稳定性和细胞 的正常生理功能。
质粒复制的生物学意义
质粒复制有助于维持其在宿主细胞内的稳定遗传， 防止质粒丢失。
质粒复制有助于基因的传播和进化，促进生物多样 性和适应性。
质粒复制在基因工程中用于克隆和表达外源基因， 实现基因的体外操作和表达。
质粒复制的基本过程
起始
质粒DNA的复制起始阶段，需要特定的起始序列和 蛋白质因子参与。
质粒不相溶性的原理、类型和机制
质粒不相溶性是指两种或者多种质粒在同一细胞内不能同时稳定存在的现象。
这种现象通常是由于质粒之间存在复制控制或者分配控制上的相互作用，导致质粒之间发生竞争或者排斥，从而使得一种或者几种质粒被淘汰或者丢失。
根据其机制，质粒不相溶性可以分为以下三种类型：一、复制控制型不相溶性：这是一种由于质粒之间共享相同或者相似的复制起点（ori）或者复制蛋白（Rep）而导致的不相溶性。
这种情况下，两种或者多种质粒会竞争细胞内的复制资源，从而使得其中一种或者几种质粒的复制受到抑制或者中断。
例如，pBR322和pUC19两个质粒都属于ColE1型质粒，它们有相同的复制起点和复制蛋白，因此在同一细胞内不能共存。
复制控制型不相溶性的机理主要有以下几种：1.RNAI-RNAII机理：这是一种通过RNA分子调控复制起点的机理，主要存在于ColE1型质粒中。
RNAI是一种小RNA分子，它可以与RNAII形成互补配对，阻止RNAII与复制起点结合，从而抑制复制起点的开放。
2.Rep-Rep机理：这是一种通过复制蛋白互相抑制的机理，主要存在于P1型和F型质粒中。
Rep是一种参与复制起点开放和启动的蛋白，它可以与其他类型的Rep形成异源二聚体，降低其活性，从而抑制复制起点的开放。
3.iteron-Rep机理：这是一种通过重复序列与复制蛋白结合的机理，主要存在于P15A型和R6K型质粒中。
iteron是一种位于复制起点附近的重复序列，它可以与Rep形成高级结构，阻止Rep 与复制起点结合，从而抑制复制起点的开放。
二、分配控制型不相溶性这是一种由于质粒之间共享相同或者相似的分配系统（par）而导致的不相溶性。
这种情况下，两种或者多种质粒会竞争细胞内的分配因子，从而使得其中一种或者几种质粒在细胞分裂时不能均匀地分配到子细胞中。
例如，pSC101和pACYC184两个质粒都含有parA和parB两个分配基因，它们编码了ParA和ParB两个分配蛋白，因此在同一细胞内不能共存。
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Regulation of plasmid copy number by iterons:
Rep 蛋白能以二体形式 结合于启动子区, 反式作 用, 对其合成进行自我调 节;
Rep 蛋白对复制具有双 向调控作用, 且视它的胞 内浓度而定, 当胞内浓度 低时起复制激活剂作用, 胞内浓度高时则起抑制 剂作用。
分离(segregation)机制有关，不能在同一细胞中并 存的质粒是因为他们共享一个或多个共同的复制因 子或相同的分配系统。(对于单拷贝质粒???)
当两种复制及调控机制毫不相干的质粒在同一个细 胞中生存时,它们各自复制,再各自分配到不同的子细 胞中,不会发生干扰。当两种复制及调控机制相关或 相同的质粒在同一个细胞中生存时,质粒复制及调控 机制就会把它们看做成同种质粒而将他们的拷贝数 控制在一定的数目内。由于细胞时质粒在子细胞中 分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后,就会造 成敏感质粒的分离丢失。
严紧型质粒 (Stringent plasmid)
松弛型质粒 (Relaxed plasmid)
拷贝数 分子量
少 (1 ～ 3 个拷贝数) 较大
多 (10 ～ 60 个拷贝数) 较小
复制方式
随细菌染色体的复制同步进行， 独立于细菌染色体而自主复制, 即只在细胞周期的一定阶段进 即在整个细胞周期中随时可以 行复制，当细胞染色体复制一 复制，当染色体复制已经停止
质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。 彼此不相容的质粒 属于同一个不亲和群(incompatiblity group)。而彼此能够共 存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。不亲和群之间的质 粒是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。
质粒不相容性的原因 质粒的不相容性现象主要是与质粒的复制调控和
在随后的细胞生长期间, 这种质粒 对也逐渐分离, 使各质粒分子的复 制起始潜力得以恢复。
⒉ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation)
在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复 制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。
反义RNA : 小RNA 分子, 长35～150 nt, 有1～4个茎-环 ( stem-loop) , 其序列与靶转录物 5' 端的一个区域互补, 又 称反转录RNA( countertranscribed RNA, ctRNA)
质粒复制的调控机制
07制性 质粒复制的调控机制 质粒不相容性(inc, incompatibility)
质粒(plasmid)
质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的 一类核酸分子
绝大多数的质粒是DNA型 目前已知只有酵母杀伤质粒(killer plasmid)是RNA型
质粒不相容性 ( plasmid incompatibility ) 指在没有选择压力的情况下，同种的或亲缘关系相近的
两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象，也称为不 亲和性(inc)。例如colE1衍生质粒，它们之间是互不相容的， 也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一 细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释) 掉。
为Rep A的mRNA 。此外在
RNA-CX 5’ 端还编码Cop B
蛋白,可抑制PA开始的转录。
翻译水平调控: CopA可同 RepA的mRNA 5’ 端部分碱 基序列互补结合,产生位阻效 应阻碍了前导肽基因(tap) 的 翻译, 进而抑制了RepA 的合 成(翻译偶联), 影响质粒复制
四 质粒不相容性
负调控模型 质粒刚移入新宿主时,负调节因子的浓度可忽略不计,
质粒能在短时间内达到正常拷贝数, 然后通过增加或减少 每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝 数(N), 使该菌群中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值(Nav ) 附近的一个很小的波动范围内。
上述控制机制是由质粒自编码的负控制系统通过调控 复制起始率而实现的, 其负控制元件就编码在质粒上。
“手铐”模型 ( “handcuffing”model)
空间位阻模型
空间位阻模型认为, 决定质粒复制 率的主要因素是重复子的浓度而 不是Rep 蛋白的表达水平。当质 粒拷贝数较低时, Rep蛋白与重复 子结合并饱和, 促发复制起始; 随 着质粒拷贝数的增加, 结合于某一 起点重复子的Rep 分子, 开始与结 合于另一起点重复子的Rep 分子 相互作用, 并通过Rep- Rep 相互 作用把2个环状质粒分子偶联起来, 形成“手铐”状的复合物, 导致这 2个重复子区域之间出现空间位阻 而阻断复制的起始。
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⑵ 抑制前导肽翻译
这种作用方式的例子是质粒R1, 它的基本复制子含有可读 框copB、tap 和repA, 分别编码转录阻遏蛋白CopB、前导 肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻译偶联的。 RepA蛋白是复制的限速因子, 以顺式作用, 但不能重复使 用, 其复制控制在转录和翻译两个水平上进行。主控制元 件是RNAⅠ,名为CopA,从repA-mRNA 前导区的一段互补 链转录而来, 长约90 nt。
绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结 构，即cccDNA (covalently close circular DNA )
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
一 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋 予宿主细胞特定的遗传性状.
质粒DNA的复制方式: 主要有“θ”型复制和滚环复制 根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制
INC 的分子生物学基础是质粒的复制调控机制存 在同源性,此外具有相同复制起始位点和分配区的 两种质粒也不能共存于同一个宿主菌
影响INC的主要因素: ⑴ 反义RNA编码区(主要决定区) ⑵ 重复子 ⑶ 复制起始位点 ⑷ 质粒分离机制(segregation system)
Thank you for your attention
次时质粒也只复制一次 时，该质粒仍然能够继续复制。
控制系统 常见质粒
单拷贝控制系统 F质粒, P1质粒
多拷贝控制系统
Col E1质粒(20～30) ; pBR322 (16 copies); pUC (30～50 copies)
二 质粒复制的调控机制
为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控 制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中, 某一质粒的拷贝数(N) 通常是一定的。
类型：
① 严紧型质粒(Stringent plasmid) ② 松弛型质粒(Relaxed plasmid) 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的， 同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型， 这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主 的控制，同宿主的状况有关。
质粒复制类型
⒈ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
在含重复子的质粒复制起点(ori) 中, 有一富AT 区和多个重复 序列(重复子) , 质粒编码的复制起始蛋白Rep 能以有序的方 式与重复子序列结合, 起到控制质粒拷贝数的作用。
在上述模式中,Rep蛋白结合在复制起始区及其附近的重复序 列上,对复制起始起着正调节作用,同时对其自身的表达起负 调节作用。
反义RNA的作用方式主要有以下两种:
⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1质粒为例来说明)
⑵ 抑制前导肽翻译
(以R1质粒为例来说明)
⑴抑制引物RNA 加工
ColE1 质粒的复制起始由一长为700 nt 的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。 RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 经构象变化后, 与模板DNA在复制起始区附近 偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 产生 游离的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 从这个游离的3’ - OH开始DNA前 导链的合成。
现在已知的复制控制方式主要有三类: ⑴ 单一元件控制; ⑵ 主、辅元件控制; ⑶ 2 种控制元件协同作用。
依所用负控制元件的类型不同, 质粒复制的控制系统主要 有: ⑴ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
⑵ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation) ① 反义RNA单独控制 ② 反义RNA 与转录阻遏蛋白共同控制
Regulation of plasmid colE1 copy number by antisense RNA:
控制复制引物与模板的 结合
RNAⅠ的启动子是组成 型的, 故其数量与质粒拷 贝数成正比, 但不稳定。
在ColE1 中还有一个质 粒编码的控制元件Rom 蛋白(又称Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 结合蛋 白, 它能增强RNAⅠ与 RNAⅡ的相互作用, 稳定 RNAⅠ- RNAⅡ复合物, 因而能加强对复制的抑 制作用, 但在上述控制回 路中只起辅助作用。
Regulation of plasmid R1 copy number by antisense RNA:
控制复制起始因子(RepA)与 Ori结合,从而抑制其上游 DnaA蛋白的结合,抑制复制 起始
转录水平调控: 在rep A基因 上游有两个启动子, PO(组成 型)和PA(调节型),分别转录产 生RNA-CX和RNA-A,均可作