实验一 低拷贝质粒的大量提取
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
质粒抽提原理和详细操作步骤
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
质粒抽提原理及详细操作步骤精编版
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取实验报告质粒DNA的提取⼀、实验⽅法碱裂解法抽提质粒DNA⼆、实验原理基于质粒DNA与染⾊体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离⼼收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离⼼管中。
2. 加⼊100µl溶液1，振荡⾄彻底悬浮。
3. 加⼊200µl溶液2，⽴即轻柔颠倒离⼼管6次，使菌体充分裂解，随后将离⼼管冰上放置3分钟4. 加⼊150µl溶液3，⽴即温和颠倒离⼼管数次，冰上放置3分钟，10，000g离⼼10min。
5. 将步骤4的上清转移⾄新的离⼼管（尽量去除杂质），加⼊等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离⼼5min。
6. 将步骤5的上清转移⾄新的离⼼管，加⼊2倍体积的⽆⽔⼄醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离⼼10分钟,弃⼄醇，保留沉淀，加⼊1ml 70％的⼄醇洗涤沉淀，10，000g离⼼5分钟8. 倒掉⼄醇溶液，⽤吸⽔纸吸净管壁上的⽔珠，室温蒸发痕量⼄醇9. 加⼊适量含RNase的TE或灭菌双蒸⽔溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加⼊荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋⽩质和脂类等物质，因此⽤碱裂解法除去杂质1、防⽌DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防⽌DNA受机械剪切作⽤降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染⾊体DNA变性2）离⼦型表⾯活性剂SDS可溶解膜蛋⽩3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染⾊体DNA形成缠连的不溶性⽹状结构，和不稳定的⼤分⼦RNA以及变性的蛋⽩质和细菌碎⽚等⼀起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染⾊染料分⼦可嵌⼊双链DNA分⼦配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分⼦筛的作⽤，因所带电荷、分⼦量⼤⼩和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分⼦数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中⼀条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
实验一_低拷贝质粒的大量提取
质粒的大量提取之细菌的培养及收集
1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。 2、将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）加入25ml对 数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养2.5h（摇床转速300转/分），所得培养 物的OD600值约为0.4。 3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170μg/ml。 有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数， 因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩 增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积 和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细 菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。 4、于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。" 5、 于4℃以5000rpm离心5min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全 部流尽。
6、上清转移到2个1.5ml离心管中（每管约0.75ml），加等体积酚/氯仿 （0.75ml/管）抽提一次，室温下12000rpm离心5min，上清各转移到新 的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇（0.75/管），充分混匀，于-20℃ 放置30min。 7、4 ℃ 条件下，12000rpm离心15min，回收核酸。 8、小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70％ 乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒 置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。 9、用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。每只EP管中加入约50ml。然后集中在一只 EP管中。 10、加入RNAase 3ml（10mg/ml）消化其中的RNA，37 ℃条件下反应1h。 取出后做好标记，交到老师处。 11、电泳检测质粒提取情况和RNA消化情况。
质粒DNA的提取和纯化实验报告
实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
2、初步了解DNA纯化的原理。
二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。
3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
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电泳检测提取质粒情况
• 每条桌子留一组同学配置1%琼脂糖凝胶， 同时负责点样和电泳，最后将电泳结果扫 描保存图片。 • 注意记住点样的顺序，并在图片上面做好 标记！
配置培养基
（用于农杆菌培养和转化） 用于农杆菌培养和转化） • 每两人准备40 ml LB培养基——用于农杆菌 感受态制备。灭菌后室温保存备用。 • 每两人准备2个LB固体培养基（每个平皿中 20 ml培养基,一个有卡那霉素,一个没有抗生 素）——用于农杆菌转化。每条桌子派一组 同学配制培养基。灭菌后4 ℃保存备用。 • 上述培养基由一组同学负责。同时这组同学 在2010年10月21日星期四pm12:00— pm2:00负责接种农杆菌，准备周五做感受以8000rpm离心10min，弃上清，敞开离心管口 并倒置离心管，使上清全部流尽。 （每个人35ml菌液） 1、将35ml 培养物的细菌沉淀物重悬于0.35ml溶液Ｉ中。 2、加0.7ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次， 以混合内容物。切勿剧烈振荡！然后将离心管放置在冰上5 分钟。 4、加0.5ml用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，反复颠倒离心瓶数 次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上 放置10min，会出现一白色絮状沉淀。（沉淀应包括染色体 ＤＮＡ、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物） 5、４℃条件下，12000rpm，离心15min。然后尽可能将上清 全部转到另一离心管中，弃去残留的粘稠状液体。
6、上清转移到2个1.5ml离心管中（每管约0.75ml），加等体积酚/氯仿 （0.75ml/管）抽提一次，室温下12000rpm离心5min，上清各转移到新 的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇（0.75/管），充分混匀，于-20℃ 放置30min。 7、4 ℃ 条件下，12000rpm离心15min，回收核酸。 8、小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70％ 乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒 置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。 9、用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。每只EP管中加入约50µl。然后集中在一只 EP管中。 10、加入RNAase 3µl（10mg/ml）消化其中的RNA，37 ℃条件下反应1h。 取出后做好标记，交到老师处。 11、电泳检测质粒提取情况和RNA消化情况。
质粒的大量提取之细菌的培养及收集
1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。 2、将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）加入25ml对 数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养2.5h（摇床转速300转/分），所得培养 物的OD600值约为0.4。 3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170µg/ml。 有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数， 因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩 增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积 和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细 菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。 4、于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。" 5、 于4℃以5000rpm离心5min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全 部流尽。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因， 可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含 有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒 的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的 一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的 两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。 质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。 由于琼脂糖中加 有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带 成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝 胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒 之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。
实验一 低拷贝质粒的大量提取
质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组 的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立 于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信 息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外 源基因构成重组体。 从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的 实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩 增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
质粒大量提取之碱裂解法
• 该法是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同 时也是Brinboim和Ｄoly(1979)及IshHorowicz和Burke(1981)所用方法的改进。 该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都 卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如聚 乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡 离心等，一并联合使用。
碱裂解法准备试剂
1、 溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下 蒸气灭菌15min，贮存于４℃。 2、 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％ ＳＤＳ 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室 温放置5-10分钟。防止NaOH接触空气中的CO2所以要现用现配。 3、 溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml。所配成的溶 液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。) 4、 溶菌酶溶液: 10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的pH值 低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。