实验一质粒提取
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
实验一低拷贝质粒的大量提取
3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170μg/ml。 有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数， 因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩 增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积 和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细 菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。
碱裂解法试验步骤
菌液收集：4℃以8000rpm离心10min，弃上清，敞开离心管口 并倒置离心管，使上清全部流尽。 （每个人35ml菌液）
1、将35ml 培养物的细菌沉淀物重悬于0.35ml溶液Ｉ中。 2、加0.7ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，
以混合内容物。切勿剧烈振荡！然后将离心管放置在冰上5 分钟。 4、加0.5ml用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，反复颠倒离心瓶数 次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上 放置10min，会出现一白色絮状沉淀。（沉淀应包括染色体 ＤＮＡ、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物） 5、４℃条件下，12000rpm，离心15min。然后尽可能将上清 全部转到另一离心管中，弃去残留的粘稠状液体。
乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒 置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。
9、用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。每只EP管中加入约50ml。然后集中在一只 EP管中。
10、加入RNAase 3ml（10mg/ml）消化其中的RNA，37 ℃条件下反应1h。 收集
1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。
实验一 质粒提取
离心分离
• 质粒DNA存在于上清中，回收
纯化
• 苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀
二、实验原理
碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差 异来分离它们的。在碱性pH，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子 浓度时，绝大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色 体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发 生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂 （乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。
五、注意事项——核酸分离、纯化
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
五、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀 会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充 分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 （TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase； pH值为8.0，可防止DNA发生酸解）
七、问题与讨论
简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以 及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的 现象及其成因。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液或者灭菌水(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
碱裂解法流程图
上清液 沉淀
对数期菌体
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
酒精沉淀
溶液II裂解
分子生物学实验
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳一、目的掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。
二、原理1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。
2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：大肠杆菌DH5α（2）分子生物学试剂10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。
50×TAE电泳缓冲液:24.2g Tris5.71g 冰乙酸10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
6×上样缓冲液:0.25% 溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。
实验一质粒的提取
实验一质粒的提取
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二） 材料
大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10
（三） 试剂
1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调
• 噬菌体
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
SDS （ 1%，新鲜配制）
• 酵母人工染色体（YAC）
• 反转录病毒载体
• 表达载体等
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
质粒提取实验报告分析
质粒提取实验报告分析引言质粒提取是分子生物学实验中常用的技术手段之一，可以用于获取目标质粒并纯化。
在本次质粒提取实验中，我们使用了传统的琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
本报告将对实验过程、结果和讨论进行详细的分析。
实验方法1. 质粒培养和提取1. 选取目标质粒进行大规模培养，添加适量的抗生素并摇床培养。
2. 收集培养液，离心沉淀并洗涤。
3. 使用琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
2. 质粒浓度检测1. 取提取得到的质粒样品，使用纳米比色计测量DNA的浓度。
2. 根据测量结果计算质粒的浓度。
实验结果1. 质粒提取情况根据琼脂糖凝胶柱层析法分离得到的质粒经紫外线照射后观察，发现提取效果良好，目标质粒很大程度上得到了纯化。
2. 质粒浓度检测根据纳米比色计的测量结果，计算得到质粒的浓度为XX ng/μl。
测量的标准曲线显示结果可靠。
结果分析1. 实验验证质粒提取的过程中，通过琼脂糖凝胶柱层析法有效地分离出了目标质粒，并得到了相对较纯的质粒样品。
通过紫外线照射观察质粒形态，进一步确认了提取效果良好。
2. 质粒浓度结果根据浓度检测结果，我们可以初步了解到质粒的含量。
这对后续实验的设计和操作非常重要。
结论通过本次实验使用琼脂糖凝胶柱层析法提取质粒，成功获得了相对纯净的目标质粒样品。
质粒的浓度检测结果进一步验证了实验的成功。
这为后续的实验研究和应用提供了基础数据。
改进和展望1. 实验中可以尝试使用其他提取方法，比较不同方法的效果并选取最佳方案。
2. 在质粒浓度检测方面，可以引入其他的分析方法，如凝胶电泳等，以更全面地评估质粒的品质。
参考文献[1] 张三, 李四. 质粒提取实验方法综述[J]. 生物技术通讯,20XX,XX(XX):XX-XX.。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
实验一质粒DNA的提取及检测
☆原理示意图 返回目录 返回原理
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、 （三）试剂：
LB培养基（液体、固体） 溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0)
溶液 I
50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶 25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，
六．注意事项
为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次) ，使蛋白
质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡5~10次 )，使质粒
DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分 开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌 握。
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
沉淀法
上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min
12000rpm，离心15min
沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）
12000rpm，离心10min
晾干沉淀
沉淀用20ul TE溶解
吸附法
吸附管用BL 500ul平衡
6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体
100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min
加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
③质粒对宿主生存并不是必需的。
Replication of plasmid
• stringent manner – 复制子（pSC101）的调节分子是RepA 蛋白，它对复制的起始具有正向作用，而对其自身基因的 转录具有负调控作用。严紧型质粒的复制需要蛋白质的不 断合成，这种质粒在每个细胞中只有1-5个拷贝。
溴化乙锭(ethidium bromide EtBr)：0.5ug/ml
荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基 之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几 乎没有碱基序列特异性。
SYBR gold fluorescence dye：
是一种特有的能够激发荧光的非对称花青 染料。
• 其灵敏度更高 • 当被波长为300nm的透射光照射时，可
Relaxed manner – pMB1/colE1复制子
质粒的应用
• 质粒的特点使质粒成 为携带外源基因进入 细菌中扩增或表达的 重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工 程中具有极广泛的应 用价值。
• 大多数基因工程使用 松弛型质粒。
常用质粒
pGEM®-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference points
超螺旋DNA＞线状DNA ＞开环DNA
2.凝胶浓度
3.电场强度
低电压时，迁移率与电压成正比。
当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范 围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的 良好分辨率，电压一般不超过 5V/cm。
4. 缓冲液离子强度
TAE 比 TBE TPE 快10% 三种的分辨率相近
凝胶上DNA的染色
重组质粒的构建包括质粒酶切、酶切产物目的片段的回收、回 收片段与载体连接等步骤，涉及一系列相互关联的酶促反应。
3. 电泳
背景知识
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1-3）β（1-4）交替构 成的线状聚合物。
Chemical Structure of Agarose
水平板凝胶电泳 垂直板凝胶电泳
• relaxed manner –在携带pMB1/colE1复制子的质粒中，正 向调节分子是一种RNA （RNAII），用作引发DNA前导链 的起始合成。其复制不需要任何质粒编码的蛋白质。完全 依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质。每个细胞中有 15-20个拷贝。
• 通过对复制子改造，拷贝数能达到500-700 （例如 pPUC19）。
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158–174
2. DNA重组
背景知识
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的 DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 +、ATP存在 的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子 进行连接。
质粒是一种小的双链环状DNA分子，是独 立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助 性遗传单位。
用于基因克隆的载体
必须具备的条件：
1）能够在寄主细胞内独立自主复制； 2）具有可检测的选择性标记； 3）具有多克隆位点； 4）具有较高的外源DNA的载装能力; 5) 具有针对受体细胞的可转移性。
载体种类：有来自大肠杆菌的质粒、λ噬菌体、 M13噬 菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色 体载体以及动、植物病毒载体。
121–140
lacZ start codon
162
lac operator
182–198
β-lactamase (Ampr) coding region
1319–2179
phage f1 region
2363–2818
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2939–2955
背景知识
1. 质粒与载体
1952， J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants.
Pouring a Horizontal Agarose Gel
影响DNA在凝胶中迁移率的因素
样品的物理性状 凝胶浓度 电场强度 缓冲液离子强度
1.样品的物理性状
DNA分子的大小
迁移率与碱基对数的常用对数成反 比。分子越大，迁移得越慢。
DNA构象
超螺旋环状 线状DNA 切口环状
质粒分子，在一定条件下，泳动率的大 小顺序为：
T7 RNA polymerase transcription initiation site
1
SP6 RNA polymerase transcription initiation site
123
T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
2982–3
SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
以发出量黄色荧光
• 1：10,000稀释使用，用电泳缓冲液当天 配置，室温存放。
模块一 重组质粒构建和重组子Байду номын сангаас筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
分子生物学与基因工程实验技术
前言
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定 模块二 植物遗传转化 模块三 转化烟草的鉴定
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
Characteristics of plasmids
①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构， 不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易 分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。