质粒DNA的提取及检测实验报告

题目：质粒DNA的提取及检测
一．实验目的:
1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；
2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

二．实验原理
1. 质粒 (Plasmid)：
一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。

2.载体(Vector)：
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。

目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。

3.分离质粒DNA：
（1）培养细菌使质粒扩增；
（2）收集和碱裂解细菌；
（3）分离和纯化质粒DNA。

4.碱裂解法
（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl
作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解
（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制
作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性
（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。

大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。

5.电泳
带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线
性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

6.提取质粒
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、
闭环超螺旋DNA 。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉
开环。

但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料
含量有关。

三．实验材料及设备
1.实验材料：
（1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；
（2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。

实验设备：
2.实验仪器：
（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；
（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.实验试剂：
（1）质粒的提取
培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调;
b.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；
c.氨苄青霉素(50mg/mL)；
d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）
作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

平衡酚密度大，可是DNA在上清中。

异戊醇防止抽提液起泡。

e.无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。

%乙醇作用：纯化质粒DNA。

缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA
（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测
a. Gold view（DNA染料）
×TAE缓冲液
c.上样缓冲液（6×）
四．实验方法及步骤
1.质粒DNA的提取
a)将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉
素50μg/mL），370C培养过夜；
b)取培养菌液置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液；
c)加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min；
d)加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰
上放置5 min；
e)加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，
产生白色絮状物，冰上放置15 min；
f)10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中；
g)向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，
v/v），振荡混匀，10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离
心管中；
h)加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm
× 2min ,取上清液于新离心管中；
i)向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置1h；
j)12000rpm × 5 min，倒去上清液，吸干液体；
k)加800μL70%乙醇，离心12000rpm × 1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味；l)加20μL ddH2O ，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。

2.DNA琼脂糖凝胶电泳检测
a)琼脂糖凝胶板的制备
b)称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加
热直至琼脂糖溶解;
c)待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，
搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内,静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子;
3.加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（ 6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。

4.电泳
将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V 左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm 处，停止电泳。

5. 观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm 的紫外灯下，观察凝胶中DNA 存在处显示出荧光条带。

五． 实验结果
图 1碱裂解法提取pEGFP-N3与pET-28A-c 质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果 Marker pET-28a-c pEGFP-N3
A 带：15000bp
D 带5000bp B 带10000bp
C 带7500bp
F 带1000bp
G 带250bp
E 带3000bp
说明：从左到右依次为：pEGFP-N3、pET-28A-c、DL15000Maker
所提取的质粒DNA可通过琼脂凝胶电泳进行检测。

一般情况下，提取的质粒为3条带。

在细胞内，质粒DNA是共价闭合环状DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA；若两条链在同一处或相近的部位断裂，则变成线性DNA分子。

在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其速度从大到小的次序为：cccDNA>线性>ocDNA，共价闭环DNA的泳动速度最快，电泳速度最快的条带显色最深。

但在优化条件下，如在冰浴中或使用试剂盒提取时，可以只出现一条带或主要出现一条带，即超螺旋带。

由图可知，本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。

与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带。

实验结果较好。

六．结果讨论与结论：
1.实验结论：
通过碱裂解方法，我们将细菌的质粒变性提出，又通过多个洗涤、纯化步骤，得到了提纯的质粒，在最后的本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。

与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带,
实验结果较好。

2.讨论一：溶液II为什么现配现用而且需放置在常温下答：
溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应变质，导致溶液ⅡpH下降，无法达到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在温度较低环境下由于溶解度下降导致析出，溶液失去效果。

3.讨论二：抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇）的作用。

氯仿：
异戊醇为什么加两次
作用：使样品中杂质蛋白变性析出，被抽提出样品；第二次加入异戊醇目的为洗净上一步抽提中样品残留的饱和酚。

4.讨论三：实验中无水乙醇与70%乙醇的作用。

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂. DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合；70％乙醇的作用不是沉淀DNA，而是通过漂洗上一步得到的沉淀，使沉淀中的盐溶解，从而进一步纯化DNA。

5.讨论四：电泳检测中忘加指示剂会出现什么情况拔梳子和
点样步骤的注意事项。

如果没有指示剂，则无法准确追踪电泳的进度。

容易导致电泳不足或者过度。

拔梳子时，应当动作轻缓，轻微左右摇晃使梳子缓慢脱出。

注意不要前后摇晃，导致跑胶起点不一或者胶板变形。

点样时，枪口要深入凹槽底部，但又不能使枪口触碰挤压胶板。