实验三革兰氏染色实验
细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告
实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2、学习无菌操作，树立无菌观念。
[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。
根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。
微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。
前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。
分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。
此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。
其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
3实验三细菌革兰氏染色
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
实验三 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法
（六）注意事项
1、革兰氏染色注意事项 （1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱 色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌； 如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰 氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇 用量多少等因素的影响，难以严格规定。 （2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响 染色效果。 （3）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或 自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
2、染色液和试剂：
3、器材：
载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、 显微镜。
（四）实验步骤
1、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）干燥：与简单染色法相同 （3）固定，与简单染色法相同 （4）初染：加适量（以盖满细菌涂面）结 晶紫染色液染色1-2分钟 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min
2、Schaeffer与Fulton氏芽孢 染色法
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的 涂片。 （2）干燥：与简单染色法相同 （3）固定，与简单染色法相同 （4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染 料以铺满涂片为度），然后用木夹子夹住涂片一 端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算 时间，约维持5min。加热过程中要随时添加染 色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太 高）。
实验三 细菌的革兰氏染色及 芽孢染色法
（一）实验目的：
1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
五、实验报告
1．结果 ． 列表比较大肠杆菌、 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G 的染色反应，并判断它们分别是 -或G+. 2．思考题 ． （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ ）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败的关键一步是什么？ 其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， ）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 可靠？
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， ）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 ）媒染：滴加碘液冲去残水， 分钟，水洗。 分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 ）脱色：将载玻片上面的水甩净， 白背景， 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 ％ 不出现紫色时为止， 秒钟， 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 ～ 秒钟 用水冲净酒精。 用水冲净酒精。 分钟， （4）复染：用番红液染 ～2分钟，水洗。 ）复染：用番红液染1～ 分钟 水洗。
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 革兰氏染色需用四种不同的溶液： （basic dye）初染液；媒染剂 ）初染液； ）；脱色剂 （mordant）；脱色剂（decolorising ）；脱色剂（ agent）和复染液（counterstain）。 ）和复染液（ ）。 • 碱性染料初染液 碱性染料初染液——结晶紫（crystal 结晶紫（ 结晶紫 violet） ） • 媒染剂 媒染剂——碘（iodine） 碘 ） • 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 脱色剂 ％的酒精（ ） • 复染液 复染液——番红 番红
微生物实验3之革兰氏染色
华中科技大学微生物学实验报告班级：生物制药1101班日期：2013 年 3 月16 日指导教师：邬建国实验组别：启明七组姓名：何明组员姓名：张玉涛、王远馨实验名称：革兰氏染色一、实验目的1.学习并掌握革兰氏染色的方法。
2.简单进行样品的革兰氏染色辨别样品中细菌类别二、实验原理1.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。
2为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。
3.革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样，染色与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。
4.阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
三、实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；检测样品：含活菌酸奶染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯四、实验方法(一)涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min ）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min ）→水洗→95%乙醇脱色（30s ）→水洗→番红复染（5min ）→水洗→干燥→镜检。
关键点：1.严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌； 而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌；2.菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。
（二)黑曲霉菌属于真菌,细胞较大,可用水片进行观察,,先在载玻片上滴一滴水,接种,盖上载玻片,即可拿到显微镜下观察.五、实验结果与分析1.对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌放大倍数40x 金黄色葡萄球菌，放大倍数100x ，油浴2.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，放大倍数100x,油浴3.酸奶中乳酸菌的革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）4.黑曲霉菌水片观察六、思考题1.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。
实验三 革兰氏染色法
三、实验器材及试剂
• 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌 18～24h 培养 物 • 革兰染色液一套（草酸铵结晶紫染液、卢 戈碘液、95%乙醇、番红染液） • 酒精灯，玻片，接种环，吸水纸，香柏油， 二甲苯，显微镜。
五、注意事项
5、染色时注意看清染料名称，按序进行、滴加染料 以能覆盖涂片为度不宜过多，要掌握好染色时间， 尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短。染色中除 脱色时摇动玻片外均要端平玻片或将其静放台面上。 染色过程中，不可使染液干枯。
6、水洗切勿先倒去染料，而是用较小水流冲洗在玻 片一端，用水流将它们缓缓带走，避免直接冲洗菌 膜处，要切忌将未经火焰固定的标本染色水洗。
④复染：加番红染液1～2滴于标本面上，染1min， 水洗后吸干。
四、实验步骤
5、镜检 用毛边纸或滤纸轻轻吸干(珍贵标本应自然干燥)，
待标本充分干燥后加油，用油镜观察并判断细菌的 染色结果。
6、实验后处理 用二甲苯擦油镜镜头后用擦镜纸擦干，整理、
清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消 毒缸中消毒5min后清洗。
四、实验步骤
2、干燥 将涂片放空气中自然干燥，或在离火焰较远处
烘干，切勿高温烘烤，因温度太高会破坏菌体形态。
3、固定 手持载玻片一端，将涂片在火焰外焰上连续通
过 3 个来回，每个来回约1s， 就可固定标本，直 到手背试触涂片反面热而不烫为宜。
四、实验步骤
4、染色
①初染：滴加结晶紫染液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ②媒染：滴加卢戈碘液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ③脱色：滴加95％酒精1～2滴于标本面上， 频频倾 动玻片， 直到不再溶下染料为止， 约30s， 视标本 片材料厚薄而增减时间，然后水洗，甩干；
实验三革兰氏染色
革兰氏染色– 染色
6 镜检 干燥后，用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。 7 混合涂片染色 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行 比较。
Procedures of Gram Staining
Gram positive or Gram negative?
实验报告
1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸 性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带 正电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在 细菌学上常用碱性染料进行染色。
2 染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染 料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染 料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有 革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽 胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。
革兰氏染色– 制片
A.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加小滴水
B. 涂成薄层
C. 固定菌体
2 初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）,染色1－2 min，水洗。 3 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜约1min，水洗。 4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙 醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般 液20－30 S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。 5 复染 用番红液复染约2min，水洗。
实验三 细菌的单染色与革兰氏 染色法
1 微生物染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进 行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化 学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样， 碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就 有化学亲和力，易于吸附。
实验三革兰氏染色
《微生物学》实验报告开课时间室：A区文科楼510 2012年11月29日学院生物工程学院年级、专业、班10级生工01班姓名吕亚慧成绩课程名称微生物学实验实验名称细菌简单染色法革兰氏染色法指导教师李苹教师评语教师签字：年月日实验目的：1．巩固油镜的使用方法；2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细菌的简单染色法；3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法；4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
实验原理简单染色法：是利用单一染料对细菌进行染色的方法，常用碱性染料。
只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。
常用的有：、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
革兰氏染色法：G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。
G ＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。
光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。
显微镜是利用凸透镜的放大成像原理，将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸，其主要是增大近处微小物体对眼睛的张角（视角大的物体在视网膜上成像大），用角放大率M表示它们的放大本领。
因同一件物体对眼睛的张角与物体离眼睛的距离有关，所以一般规定像离眼睛距离为25厘米（明视距离）处的放大率为仪器的放大率。
显微镜观察物体时通常视角甚小，因此视角之比可用其正切之比代替。
显微镜由两个会聚透镜组成，光路图如图所示。
物体AB经物镜成放大倒立的实像A1B1，A1B1位于目镜的物方焦距的内侧，经目镜后成放大的虚像A2B2于明视距离处。
实验器材变形杆菌、表皮葡萄球菌载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
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经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌
为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染 上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
Gram stain of Gram -
Gram stain of Gram +
实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细
胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被 染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合 成结晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用 脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成 的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细 胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低， 从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内， 经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则 不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以 当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使 结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染 后，细胞被染上复染剂的红色。
实验三 革兰氏染色法
河南城建学院环境科学与工程实验中心 环境生物技术实验室
一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。
二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain
Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染
步骤1：涂片
步骤2：干燥
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
步骤三 固定 步骤四 染色
crystal violet stain 结晶紫染色
wash with water 水洗
Stain with gram's iodine solution 碘液复染
Decolorize by adding 95% alcohol 95%酒精脱色
Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall
三、器材：
大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，
载玻片，显微镜等
四、操作步骤：
1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌 （24h）分别涂片、干燥、固定。
Counterstain with Safranin 沙黄复染
Results of stain 染色结果
五 注意事项
1）注意涂片不宜过。 2）火焰固定温度要适宜。 3）注意控制好脱色程度。
六、实验报告： 1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结 果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。 2、思考题： 1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓 厚？其染色成败的关键步骤是什么？ 2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 3）造成革兰氏染色结果不正确（假阴性 或假阳性）的主要原因有哪些？
2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗 至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1--2分钟，水洗
3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色 为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对 比观察。