实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
细菌涂片制备及革兰氏染色
实验内容：
1、 单菌革兰氏染色 2、 三区混合染色
A菌
A、B混合区
B菌
五、实验结果
记录所观察到的三种细菌革兰氏染色结 果
绘出显微镜下三种细菌的形态
六、问题与讨论
要得到正确的革兰氏染色结果必须注意 哪些操作？哪一步是关键？Why?
思考题：
P84：2（1）（2）（4）
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！ 请值日同学留下值日 下周再见！
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。
3. 媒染：先用新配的卢戈氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。
4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立即 用流水冲洗。
5. 复染：滴加番红染色液，染3－5 分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6. 镜检：观察染色结果并绘图。
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂 质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了 类脂质，增加了细胞的通透性，使初染 的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙 黄复染呈红色。
G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后， 肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细 菌仍保留初染时的紫色。
实验二步掌握细菌的革兰氏染色 法。
了解革兰氏染色法的原理及其在细 菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
三、实验材料
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
革兰染色实验报告
革兰染色实验报告革兰染色实验报告引言：革兰染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，由丹麦细菌学家克里斯汀·格拉姆于1884年发明。
该实验通过对细菌细胞壁的染色特性进行观察，将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。
本实验旨在通过革兰染色方法，观察不同细菌的染色特性，从而更好地了解细菌的结构和分类。
材料与方法：1. 细菌培养物：本实验使用了两种细菌培养物，分别为革兰阳性细菌A和革兰阴性细菌B。
2. 玻璃片：用于制作细菌涂片。
3. 革兰染色试剂：包括革兰碘液、乙醇、脱色剂和碱性紫。
实验步骤：1. 准备细菌涂片：取少量革兰阳性细菌A和革兰阴性细菌B，分别在两片玻璃片上均匀涂抹。
2. 固定细菌涂片：将涂片在火焰中迅速加热，使细菌固定在玻璃片上。
3. 染色处理：将革兰碘液滴在细菌涂片上，静置1分钟后用纯净水冲洗。
然后滴加乙醇，使其脱色，再用纯净水冲洗。
最后滴加碱性紫染色剂，静置30秒后用纯净水冲洗。
4. 镜检观察：将涂片放在显微镜下，使用100倍和1000倍的放大倍数观察细菌的染色情况。
结果与讨论：观察了多个视野下的细菌涂片后，得出以下结果：1. 革兰阳性细菌A：在革兰染色后，细菌呈现紫色，细胞壁较厚，能够保留革兰染色的紫色染料。
细菌形状多为球形或椭圆形。
2. 革兰阴性细菌B：在革兰染色后，细菌呈现粉红色，细胞壁较薄，无法保留革兰染色的紫色染料。
细菌形状多样，有球形、杆状等。
通过对实验结果的观察和分析，可以得出以下结论：1. 革兰染色方法能够有效地将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。
革兰阳性细菌具有较厚的细胞壁，能够保留革兰染色的紫色染料；而革兰阴性细菌则具有较薄的细胞壁，无法保留紫色染料。
2. 革兰染色方法对于细菌的形态和结构有一定的指示意义。
革兰阳性细菌多为球形或椭圆形，而革兰阴性细菌则形态多样，有球形、杆状等。
结论：革兰染色是一种简单而有效的细菌分类和鉴定方法。
通过该方法，可以快速了解细菌的染色特性、形态和结构，为进一步的细菌鉴定和分析提供基础数据。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
细菌标本片的制备及染色法.
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上 以固定标本，1～3min后， 再滴加与染色液等量的磷 酸缓冲液或中性蒸馏水于 玻片上，轻轻摇晃使与染 色液混和均匀，5min左右 水洗，干后镜检
• 注：瑞氏染液含甲醇，无需另 行固定
瑞氏染色镜检结果
细菌（蓝色） 细胞
(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩
取细菌培养液1～2环，在玻片上作 直径1cm的涂面
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
• 室温下自然干燥或 将标本片的涂面向 上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥。
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
水洗 水洗 水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血 液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上， 以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
– 组织病料（肝脏）：触片及美兰染色 – 固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革
兰氏染色 – 液体病料：血涂片及瑞士染色
3. 镜检结果 4. 注意事项
实验二、细菌染色法
微生物分类鉴定的特征
形态学和生理生化特征 血清学实验和噬菌体分型 氨基酸序列和蛋白质分析 核酸碱基组成和序列分析
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色 运动性
察(防止水的折射，以便于观察)。
Microbiological Sterile Techniques
实验二 细菌染色法
一、目的要求
1、掌握细菌染色标本的制备。
2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操
作步骤。
3、熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。
二、基本原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使
菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，
从而有利于对细菌标本的观察。 细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。
染色时间：
吕氏碱性美蓝染色1~2min； 石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗
将细菌涂片上染液倒入废液缸中； 手持细菌染色涂片，臵于废液缸上方，用 洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无 色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使 水从载玻片的一端流下。水流不宜过急， 过大，以免涂片薄膜脱落。
呈红色。
革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分 占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌
肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（<50） 无 类脂质 一般无（ < 2） 蛋白质 无 含量较高（~20） 含量较高
革兰氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药
细菌的革兰氏染色实验操作步骤流程
细菌的革兰氏染色实验操作步骤流程革兰氏染色是一种常用的细菌分类方法，通过染色技术可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这种染色方法简单快捷，对细菌的形态特征有着重要的观察作用。
本文将介绍细菌的革兰氏染色实验的详细操作步骤流程。
实验所需材料1.革兰氏染色试剂盒：–革兰碘液–革兰染色液–醇解液–洗涤液–脱水液2.细菌培养液3.玻璃载玻片4.导览盖玻片5.消毒棉球6.显微镜实验步骤1.预处理玻片和试管–用肥皂水洗净手并彻底冲洗干净。
–取一块干净的抹布或纸巾，将玻璃载玻片擦拭干净。
–取一块干净的纸巾蘸取少量醇解液擦拭玻璃载玻片表面，以去除可能存在的杂质。
–将试管清洗干净，用蒸馏水冲洗干净，并放置在烘箱中晾干。
2.制备细菌涂片–打开培养液管，将一滴细菌培养液滴在玻璃载玻片上，可略带颜色。
–将玻璃载玻片侧倾45度，用细胞棉棒轻轻均匀地将细菌培养液涂抹在玻璃载玻片上，尽量避免涂片过厚。
–将涂片晾干。
3.固定细菌涂片–将制备好的细菌涂片放入烘箱中，用50摄氏度温度固定5分钟。
–取出固定的细菌涂片，待冷却后准备进行染色处理。
4.革兰氏染色处理–取一滴革兰碘液，滴在细菌涂片上，静置1分钟。
–洗涤液冲洗：将细菌涂片放入洗涤液中，静置20秒，然后将涂片提起，用自来水轻轻冲洗10秒。
–脱水液处理：将细菌涂片放入脱水液中，静置20秒。
–将细菌涂片提起并用洗涤液清洗3次，每次间隔10秒。
–将细菌涂片放入洗涤液中，静置20秒。
–用细胞棉棒从上到下蘸取革兰染色液，均匀地在细菌涂片上涂抹。
–将细菌涂片放入革兰染色液中，静置1分钟。
–将细菌涂片提起并用洗涤液轻轻冲洗10秒。
–将细菌涂片放入醇解液中，静置1分钟。
–将细菌涂片提起并用洗涤液轻轻冲洗10秒。
5.干燥和观察–用吹风机或自然风将细菌涂片吹干。
–涂片完全干燥后，将其放置在显微镜载片夹上。
–用显微镜在低倍镜下观察涂片，然后转换到高倍镜下观察。
观察细菌在镜片上的染色结果和细菌形态。
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。
火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。
此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
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革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组 成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒 染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。 用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要 由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细
革兰氏染
色法动画
革兰阳性菌
革兰阴性菌
革兰氏
染 色法
革兰氏染
色法动画
实验报告：
1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。
细菌的单染色
涂片 干燥 固定
水洗、吸干 镜检 染色1~2min
细菌抗酸染色
1. 初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰 高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发 减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用 水冲洗。
G+菌与G-菌细胞壁的区别
细胞壁
强 度 厚 度 肽聚糖层 肽聚糖量 糖类量 脂类量 磷壁酸 外 膜
革兰阳性菌
较坚韧 21~80nm 可达50 层 50%~80% 约45% 1%~4% ﹢ ﹣
革兰阴性菌
较疏松 10~15nm 1~2层 5 %~80% 15%~20% 11~22% ﹣ ﹢
革兰氏染色法过程示意图
2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。
3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法
Байду номын сангаас
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
革兰氏染色法： 1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、 固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的 乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。
2. 脱色: 3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。
3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用 油镜观察。
胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不
易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理
时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较
容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。
实验二 细菌涂片的制备和染色镜检
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。 实验内容： 1、 细菌抹片的制备：
细菌抹片
的制备
玻片准备：透明、洁净、无油渍。 抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。 干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。