血涂片制备染色及白细胞形态(ZCG)
血涂片的制作及免疫细胞的形态观察
山东师范大学生命科学学院 杨桂文
一、实验目的
①掌握微量采血及血涂片的制作方法 ②学习使用光学显微镜观察免疫细胞
二、实验原理
血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液 学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞 的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同 免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞 中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及 细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。
3．染色 ．
待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满 血膜为止，染色1~3min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4） 或蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。
4．封片 ．
经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶封片保存。
5．观察 ．
分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血 细胞类型。
五、实验报告
拍摄血细胞照片，标出并分析比较各种 免疫细胞类型和形态特征。
2．涂片 ．
挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光 滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触 及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以 30~40O为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄）， 轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进 时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。
三、实验器材
器材： 器材 医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗
净的载玻片等
试剂：瑞氏（Wright）染液，瑞特氏染料0.1克溶于60ml 试剂
甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要 先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使 染料溶液得更好。）
四、实验步骤
1．采血 ．
血涂片制备与染色
.
5
涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将 血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对 血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、 细胞大小测量等工作。
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6
血涂片制备
推片 血液
载玻片
一张满意的血涂片应厚薄均匀
头
体
尾鲜明
.
涂片干燥后用铅笔在血涂片的头 部写上姓名和编号
B 123
李 四
7
方法与步骤1：采血，挤出第二滴血置于载玻片的右侧
血涂片制备与染色
.
1
【目的】 掌握血涂片的制备和染色方法。
【原理】 将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层 紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的 Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质 如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸 性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中 的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中 的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色； 中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝 均可结合，染成淡紫红色。
.
8
2.再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先 向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。
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9
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10
两玻片的角度以30-45°为宜，轻轻将双凹片向 前匀速推进，即涂成血液薄膜。
30~45°
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11
3.成片，干燥
一张满意的血涂片应厚薄均匀
头
体
尾鲜明
李 四
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12
[血涂片质量评价]
.
23
6.血涂片的观察
低倍镜观察 1.染色情况(满意、偏酸、偏碱） 2.细胞分布情况 油镜下分类计数：体尾交界处。 油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。（共计
血涂片制作与白细胞分类计数
淋巴细胞
1.细胞大小为7～15µm。 2.细胞核与细胞浆比率 为5:1～2:1。 3.细胞呈圆形或卵圆形。 4.细胞核通常呈圆形或 卵圆形；偶见核凹陷或 轻度切迹。 5.核染色质散在致密或 粗颗粒状聚集；副染色 质无或少量。 6.无核仁；有时，可见小的、淡的核小体。 7.细胞浆少至中等量；淡蓝色至中度嗜碱性；可见核周淡染区； 有时有副核窝；小淋巴细胞无颗粒；大淋巴细胞的细胞浆较多， 含少数粗大嗜天青颗粒。
单核细胞
1.细胞大小为12～20µm。 2.细胞核与细胞浆比率 为4:1～2:1。 3.细胞呈圆形，可有伪足。 4.细胞核形态各异，呈圆 形、卵圆形、马蹄形、 切迹形或分叶形。 5.核染色质轻度聚集。 6.无核仁。 7.细胞浆含蓝灰色颗粒，少量空泡。
1.手工涂片法
取一滴血滴于洁净无油脂的玻片一端. 左手持玻片，右手再取边缘光滑的另 一玻片作为推片。将推片边缘置于血 滴前方，然后向后拉，当与血滴接触 后，血即均匀附在二玻片之间。此后 以二玻片约呈30—45度的角度平稳地 向前推至玻片另一端，推时角度要一 致，用力应均匀，即推出均匀的血膜 （血膜不可过厚、过薄）。将制好的血
（4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左 右时亦可代用）。冲洗血膜时应将玻璃片持平， 冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸 取水分迅速干燥，即可镜检。
血涂片的染色步骤：
判断染色结果：红细胞
淡红色，无核的圆形细胞，因红细胞为双凹形，故边缘部 分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。
颗粒白细胞
•
2.细胞呈圆形或卵圆形。
•
细胞核分叶，叶间有丝状
•
连接，分为2～5叶。
•
3.核染色质聚集。
•
4.无核仁。
医院血涂片制备及染色操作规程
XXXX医院血涂片制备及染色操作规程一、载玻片的清洁二、血涂片制备三、血细胞常用染色方法1、瑞士染色法2、染色原理3、吉姆萨染色法4、瑞士-吉姆萨符合染色法血涂片染色显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本方法，主要用于红细胞、白细胞、血小板形态等检查，还可以用于白细胞、血小板的数量评估。
在临床应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。
如果血图片制备不良，染色不佳，常使血细胞的形态学鉴别和诊断发生困难，甚至导致错误的结论。
如果血膜过厚则使细胞重叠缩小，血膜太薄易导致细胞分布不匀，白细胞多集中于边缘。
因此，制备厚薄适宜、头体尾分明、染色良好的血涂片，是血细胞形态学检查最基本的要求，必须以认真负责的态度注意操作过程中的每一个环节。
一、载玻片的清洁新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用浓度约1mol/L HCL 浸泡24小时后，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。
用过的载玻片可放入适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20分钟，趁热将血膜刷洗干净，再用清水反复冲洗，必要时用蒸馏水最后浸洗后干燥备用。
使用载玻片时，切勿用手触及拨片表面，以保持玻片清洁诶、干燥、中性、无油渍。
二、血涂片制备血图片的制备方法很多，有手工推片法、载玻片压拉法及棕黄层涂片法等。
血液涂片既可直接用非抗凝的静脉血或毛细血管血，也可以用经EDTA抗凝的血液制备。
由于EDTA能阻止血小板聚集，显微镜下观察血小板形态时长采用，但EDTA抗凝血有时能引起红细胞皱缩和白细胞聚集，因此最好使用非抗凝血制备血涂片。
一张好的血涂片，要求厚薄适宜、头体尾分明、边缘整齐、两侧应留有空隙。
临床上用的普通手工推片法是取血标本一滴置载玻片的一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿方向接触血液，使血液沿推片散开，通常推片与载玻片保持30度~45度夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。
图片侯宝与血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容有关。
血涂片的制备与染色
血涂片制备与染色血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。
血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。
血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。
（一）血涂片制备1.载玻片的准备新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。
旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。
使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。
2.血涂片制作方法取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。
涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。
血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。
一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。
（二）血涂片染色染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。
血涂片染色包括两个过程：固定和染色。
固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。
常用的染色方法有瑞特染色法（Wright）、姬姆萨染色法（Giemsa）等。
1.瑞特（Wright）染色法为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。
血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。
目前常用瑞特染色法。
（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。
亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。
通常为氯盐，即氯化美蓝。
美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。
血涂片制作、染色白细胞分类计数 PPT课件
❖ 染色：染色5～10min. ❖ 沖洗：不要先倒掉染液，平持血塗片用流水緩緩沖洗乾淨。 ❖ 乾燥：直立血塗片，使其自然乾燥。 ❖ 低倍鏡觀察 ❖ 油鏡觀察 ❖ 計算 求出各類細胞所占的百分率。
2021-11-7
1
思考題
• 試述外周血白細胞正常形態特徵和異常形
低倍鏡下所見
1
各類成熟白細胞的形態學：
中性粒細胞（Ne）：圓形，直徑10～13µm，
胞漿染淡桔紅色，核形可呈杆狀核或2至5葉不等， 以3葉多見，染成深紫紅色，質地粗糙，胞漿中有 許多細小均勻紫紅色顆粒。
2021-11-7
1
嗜酸性粒細胞（Eo）：較中性粒細胞
稍大，胞核多為兩葉，呈眼鏡、八字形， 核染色質粗糙染深紫紅色，胞漿內充滿 粗大均勻的嗜酸性顆粒，瑞氏染色時呈 桔紅色，有折光性。
2021-11-7
1
• 血紅蛋白、嗜酸性顆粒為鹼性物質，故與
酸性染料伊紅結合而染成紅色，呈嗜酸性。
• 細胞核的核蛋白與原、幼細胞的胞漿為酸
性物質，故與鹼性染料美蘭和天青結合， 染成深藍色或深紫紅色，呈嗜鹼性。
• 中性顆粒與美蘭和伊紅同時結合而染為淡
紫紅色，呈嗜中性。
2021-11-7
1[器材]ຫໍສະໝຸດ • 光學顯微鏡洗乾淨。
❖乾燥：直立血塗片，使其自然乾燥。
2021-11-7
1
3．白細胞分類：
先用低倍鏡選擇厚薄適宜，染色良好， 細胞分佈均勻的體尾交界處，滴加香柏 油一滴，油鏡下分類計數。分類時要有 秩序的連續進行，避免主觀選擇視野。 通常分類計數100個白細胞，計算並報 告各種白細胞所占比例。
2021-11-7
血涂片制备染色及白细胞形态(ZCG)
注 意 事 项 推片
3.良好的血涂片,厚薄适宜,头体尾分明,分 布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。
血滴越大，角度越大，速度越大，血膜越厚。
4.血涂片干透后方可染色，否则染色过程中 血膜容易脱落。血涂片制好后最好立即固定 染色,以免细胞溶解和发生退行性变。
头
体
尾
将推片匀速向前，勿停顿。涂 片的厚薄取决于速度和角度。
涂片干燥后用铅笔在血涂片的头
部写上姓名和编号
B 123
李 四
2. 血 涂 片 染 色
涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液58滴覆盖整个血膜1分钟
再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴，Ⅰ 液和Ⅱ液充分混匀静置5分钟
直接在无血膜处 流水冲洗3-5分钟
123
血涂片干燥后用油镜分 类计数200个白细胞
试剂：瑞吉氏染液、磷酸盐缓冲液、香柏油、 乙醇-乙醚溶液。
标本：抗凝血。
1. 血 涂 片 制 备
血液充分抗凝。
微量吸管虹吸取血7-8μl，置 血滴于载玻片一端。
左手持载玻片，右手持推片， 将推片置血滴前方，向后移 动到接触血滴，使血滴沿推 片边缘展开成线状。
血涂片制备
推片 血液
载玻片
一张满意的血涂片应厚薄均匀
李 四
3. 血涂片的观察
低倍镜观察
1.染色情况(满意、偏酸、偏碱） 2.细胞分布情况 油镜下分类计数：体尾交界处。 油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。
李 四
123
中性分叶核粒细胞 嗜酸性粒细胞
中性杆状核粒细胞 嗜碱性粒细胞
单核细胞 淋巴细胞
正
中性杆状核粒细胞
常
临床血液学检验基础
正常血片中大颗粒细胞
白细胞数量异常
中性粒细胞增多 中性粒细胞减少 淋巴细胞增多 淋巴细胞减少 单核细胞增多 单核细胞减少 嗜酸性粒细胞增多 嗜酸性粒细胞减少 嗜碱性粒细胞增多 嗜碱性粒细胞减少
未成熟粒细胞（早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚 幼粒细胞）
粒细胞数量增高
粒细胞数量减低
白细胞减少症的诊断 ：中性粒细胞＜1.5×109/L为粒细胞减少症； ＜0.5×109/L时称为粒细胞缺乏症。 白细胞减少症的鉴别诊断
或合成洗涤剂清洗。目的：保持玻片接近中性
二：手工推片：先后移，后前推（30-45度），匀速，平稳； 血滴大，角度大，速度快，血膜厚，反之，则血膜薄。
瑞氏染色（Wright染色）
瑞氏染料由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝
（M+）组成。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红； 二是固定细胞形态。 原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。 各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力
染色质（H-J）小体
碱性点彩
卡博氏环
红细胞包涵体
胞内微生物：细菌、真菌、原生体或寄生
虫感染患者红细胞内或红细胞间游离
疟原虫
巴贝虫
红细胞包涵体
Pappenheimer小体(含铁血黄素颗粒) 红细胞内铁蛋白聚集物，血片瑞氏染色可见多 个大小不等、形状不定、通常分布在一个较限制的胞 浆局域内的嗜碱包涵体 ，铁染色（+）
红细胞包涵体
有核红
NRቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC存在，用于WBC分类或计数 校正
出现幼红细胞、巨幼红细胞
幼红细胞
巨幼红细胞
网织红细胞
RET是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡细胞，其胞质中残存的嗜碱性物 质RNA经碱性染料（如煌焦油蓝、新亚甲蓝）活体染色后，形成蓝色或紫色的点 粒状或丝网状沉淀物。网织红细胞自骨髓释放到外周血液后仍具有合成血红蛋白 的能力，约1-2天后，过渡为成熟红细胞
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注 意 事 项 推片
3.良好的血涂片,厚薄适宜,头体尾分明,分 布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。
血滴越大，角度越大，速度越大，血膜越厚。
4.血涂片干透后方可染色，否则染色过程中 血膜容易脱落。血涂片制好后最好立即固定 染色,以免细胞溶解和发生退行性变。
试剂：瑞吉氏染液、磷酸盐缓冲液、香柏油、 乙醇-乙醚溶液。
标本：抗凝血。
1. 血 涂 片 制 备
血液充分抗凝。
微量吸管虹吸取血7-8μl，置 血滴于载玻片一端。
左手持载玻片，右手持推片， 将推片置血滴前方，向后移 动到接触血滴，使血滴沿推 片边缘展开成线状。
血涂片制备
推片 血液
载玻片
一张满意的血涂片应厚薄匀
注 意 事 项 染色
5.PH值影响细胞染色,配制染液必须用优质甲醇,稀释染 液必须用缓冲液,近中性水冲洗,否则各种细胞染色反应 异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。
6.染色时间与染液浓度、室温高低、细胞多少有关。染 液越淡、室温越低、细胞越多,染色时间越长或适当增 加染液量。
7.染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血涂片上难 冲洗干净。流水冲去染液,不能先倒掉染液,以免染料沉 着于血涂片上。冲洗时间不宜过久，以防脱色。
头
体
尾
将推片匀速向前，勿停顿。涂 片的厚薄取决于速度和角度。
涂片干燥后用铅笔在血涂片的头
部写上姓名和编号
B 123
李 四
2. 血 涂 片 染 色
涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液58滴覆盖整个血膜1分钟
再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴，Ⅰ 液和Ⅱ液充分混匀静置5分钟
直接在无血膜处 流水冲洗3-5分钟
123
血涂片干燥后用油镜分 类计数200个白细胞
体积最大，细胞圆形。胞浆中有灰蓝色粉尘样颗粒。 核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
淋巴细胞
小淋巴细胞：与红细胞大小相似，圆形，核致密，染成 深紫色。周围细胞质嗜碱性，染成淡蓝。
大淋巴细胞：较大，核圆形。直径11-15 μm 。
红细胞
淡红色，无核的 圆形细胞，因红 细胞为双凹形， 故边缘部分染色 较深，中心较浅， 直径6-9μm。
作业
1. 6种白细胞形态绘图。 2.本次实验的关键环节是什么？
李 四
3. 血涂片的观察
低倍镜观察
1.染色情况(满意、偏酸、偏碱） 2.细胞分布情况 油镜下分类计数：体尾交界处。 油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。
李 四
123
中性分叶核粒细胞 嗜酸性粒细胞
中性杆状核粒细胞 嗜碱性粒细胞
单核细胞 淋巴细胞
正
中性杆状核粒细胞
常
细
胞
形
态
胞体：圆形，直径 10-15μm。 胞浆：胞质量丰富，充满浅红色中性颗粒。 胞核：核形不一，呈S形、U形等，核色质粗糙成块。
血涂片制备、染色 及白细胞形态观察
医学检验系
实验内容
1.血涂片制备 2.血涂片染色 3.正常白细胞形态观察
目的：掌握血涂片的制备方法、瑞吉氏染色方 法，观察正常白细胞形态。
染色原理：根据不同种类细胞及细胞的不同成分 ，对酸性及碱性染料结合能力不同， 而使各种细胞呈现各自的特点。
器材：载玻片、推片、染架、吸耳球、显微镜、 微量吸管、拭镜纸。
中性分叶核粒细胞
细胞核被染成紫色分叶状，可分3-5叶。
嗜酸性粒细胞
略大于嗜中性粒细胞，细胞核染成紫色，通常为2叶， 胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成桔红色。
嗜碱性粒细胞
体积略小于嗜酸性粒细胞，细胞中有大小不等被染成紫 色的颗粒，颗粒数目较嗜酸性粒细胞的颗粒少，核1-2叶， 染成淡蓝色。
单核细胞
血小板
形状不规则，一般呈圆形，比红细胞和白细胞小得多， 无细胞核，有质膜。 血小板在长期内被看作是血液中无功能的细胞碎片。
注 意 事 项 玻片
1.玻片清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用 清洗液或10%盐酸浸泡24h,然后再彻底清洗。用 过的玻片可放入适量肥皂水煮沸20min,再用热 水将肥皂和血膜洗去,自来水反复冲洗,必要时 再置95%乙醇中浸泡1h,然后擦干或烤干备用。