血涂片的制备与染色
实验五血涂片的制备和染色血细胞形态观察与血型鉴定
目的要求
学习掌握人血涂片制备和染色方法； 观察各种血细胞的形态。
实验材料
显微镜、载玻片、酒精棉球、采血针、 瑞氏染液
实验步骤
人血涂片的制备
一 次 推 成， 不 可 来 回 推！
实验步骤
血涂片的染色：瑞氏染色法
滴1-2滴甲液在血涂片上，盖满血片； 1min后滴加1.5倍的乙液，立即吹匀两液； 静置10～15min，用清水洗去染液； 干燥。
的血清中，混匀（每边各用一牙签，切勿混用）； 观察：室温下静置10min后，观察凝集现象。
A标准血清（抗B） B标准血清（抗A）
O A
B AB
实验结果
绘制各种血细胞图； 鉴定自己的血型； 讨论血液凝集的机理。
Ag type Ab type
实
B
验
原
理
A
None
ABO血型
A and B
实验原理
实 验 原 理
血液凝集
实验步骤
取一块清洁玻片，用记号笔在左上角写A， 右上角写B。
将A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，B型标 准血清（抗A）一滴加入右侧。
A标准血清（抗B） B标准血清（抗A）
实验步骤
采血：用75％酒精棉球消毒指尖，采血针采血； 取血：用两根牙签各取一小滴血分别放入载玻片
实验步骤 血细胞的观察：显微镜下观察各类血细胞
血涂片 红细胞
血小板
未成熟中性粒细胞
嗜酸性粒细胞
大淋巴细倍
（二）、血型鉴定
目的要求
学习ABO血型的鉴定方法； 观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型鉴定的
原理。
实验材料
显微镜、载玻片、酒精棉球、采血针、 A型和B型标准血清
血液一般检验—血涂片制备与染色(临床检验课件)
免疫学及临床检验教研室
良好的血涂片要求:
厚薄适宜, 头体尾分明, 细胞分布均匀, 边缘整齐, 血膜与载玻片的 两边和两端各留有0.3cm和0.5cm的空隙, 血膜长度占载玻片的2/3 左右。
免疫学及临床检验教研室
常见血涂片质量不佳的原因:
免疫学及临床检验教研室
2. 厚血膜涂片法
取新鲜血液1滴于载玻片的中央, 用推片 的一角将血滴由内向外旋转涂布, 制成厚薄均 匀、直径约1.5cm的圆形血膜, 待自然干燥后, 滴加数滴蒸馏水, 使红细胞溶解, 脱去血红蛋 白, 倾去水, 血涂片干燥后即可染色并用显微 镜检查。
免疫学及临床检验教研室
将推片与载 片保持30°-45° 夹角, 平稳向前 推进至载玻片的 另一端, 残片上 即留下一薄层血 膜。
免疫学及临床检验教研室
血膜的影响因素:
（1）血滴大小、 （2）推片与载玻片之间的角度、 （3）推片时的速度有关。
血滴愈大、角度愈大、推片时速度愈快, 则血膜愈厚；反之 血膜愈薄。
载玻片的清洁 血涂片的制备 常见问题处理
免疫学及临床检验教研室
血涂片的制备
• (一） 载玻片的清洁 • （二） 血涂片的制作
免疫学及临床检验教研室
（一） 载玻片的清洁
1. 新玻片 1mol/L HCl泡24小时→水洗→干燥。 2. 旧玻片 肥皂水或其他合成洗涤剂水中煮沸20分钟→热水洗→自 来水洗→干燥。(→95%乙醇泡1小时→蒸馏水洗→干后备用)。
染色时常用缓冲液（pH6.4～6.8）来调 节染色时的pH值，以达到满意的染色效 果（表1-11）。
免疫学及临床检验教研室
【染色方法】 1. 加瑞特染液,固定细胞0.5～1min。 2. 加等量或1.5倍量的缓冲液, 并与染液吹匀, 室温下染色 10min左右。 3. 冲洗待干。
血涂片的制备、染色、观察方法、复检
04
章节 PART
血涂片的复检
血涂片的复检
血涂片复检的意义，首先是复核该复检标本的血常规报告的准确性， 其次是在观察血细胞形态时，根据所观察到的外周血细胞形态，提供给临 床有效的信息，要做到保证血常规结果的准确、不漏检、不误诊、不误导。 切实的结合临床，关注已知的患者信息，查看患者的相关检查结果，了解
靠等待自然干燥章。节 PART
血涂片的染色
4、瑞氏染色是最经典，最常用的染色法，尤其对于细胞质成分，中 性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染 液对细胞核着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采
用瑞-姬姆萨章复节合染PA液R可T使细胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
患者出现的体章征节、P症A状R（T 必要时要询问临床医生），在此基础上，了解临
床医生的诊断或治疗思路，然后在显微镜下有目的地进行查找，才能做到 有百密而无一疏。
红系统细胞形态
一、正常红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
二、红细胞大小改变
章节 PART
红系统细胞形态
三、红细胞血红蛋白含量改变
章节 PART
章节 PART
红系统细胞形态
3、卡波环
章节 PART
红系统细胞形态
4、有核红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
5、网织红细胞：是指晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红 细胞之间的过度细胞，分为4型。Ⅰ型：丝球形，Ⅱ型：网型， Ⅲ型：破网型，Ⅳ型：点粒型（图2-165、2-166、2-167）
红系统细胞形态
章节 PART
血涂片的制备
二、将推片接近血滴处，然后轻轻接触血滴并压在血滴上，使血滴呈”一”字型展开, 充满推片宽度(如果能做到边缘血量较少,中间血量稍多为最佳)(图1-2,图1-3).
血涂片制备与染色
血涂片制备与染色一、血涂片制备【器材】清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片(25 mm x75 mm ，厚度为0.8-1.2mm) 。
【操作】血涂片制备方法很多，目前临床实验室普遍采用的是手工推片法，在玻片近端1/3 处，加一滴(约0.05 ml) 充分混匀的血液，握住另一张边缘光滑的推片，以30°- 45°角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端。
【附注】1. 血涂片通常呈舌状或楔形，分头、体、尾三部分。
2. 推好的血涂片应在空气中晃动，使其尽快干燥。
天气寒冷或潮湿时，应于37℃恒温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。
3. 涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。
一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚;反之则血膜薄。
红细胞比容高于正常时，血液黏度较高，保持较小的角度，可得满意结果;相反，红细胞比容低于正常时，血液较稀，则应用较大角度、推片速度应较快。
4. 血涂片应在1 h 内染色或在1 h 内用无水甲醇(含水量<3% )固定后染色。
5. 新购置的载破片常带有游离碱质，必须用浓度约1 mol/LHCL浸泡24 h 后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。
用过的载玻片可放人含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20 min ，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馆水最后浸洗，擦干备用。
使用时，切勿用手触及玻片表面。
二、血涂片染色(一)瑞氏( Wright) 染色法【原理】瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。
各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲合力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。
【试剂】1.瑞氏染液(1)瑞氏染料0.1 g(2)甲醇(AR) 60.0 ml 。
瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成。
将瑞氏染料放人清洁干燥研钵里，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将己溶解的染料倒人棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。
血涂片的制备与染色实验报告
血涂片的制备与染色实验报告血涂片的制备与染色实验报告简介本报告旨在介绍血涂片的制备与染色实验方法及步骤，以及相关注意事项和结果分析。
实验步骤1.准备所需材料：–血液样本–血涂片载玻片–血液涂片器–双氧水–细胞染色剂–拖尾液–显微镜片2.制备血涂片：–取一滴血液样本，滴于载玻片中。
–使用血涂片器，将血液涂片器顶端垂直贴附在载玻片上。
–慢慢向后移动血涂片器，使血液样本均匀地涂布于载玻片上。
3.干燥血涂片：–将制备好的血涂片放置于通风处，自然晾干。
4.染色处理：–将已干燥的血涂片浸入双氧水中，浸泡5分钟，用来溶解红细胞。
–用显微镊子夹取血涂片，轻轻晃动10次，使红细胞充分分散。
–轻轻将血涂片冲洗干净，以去除残留的双氧水。
–将血涂片浸入细胞染色剂中，染色1分钟。
–将血涂片冲洗干净，确保没有染色剂残留。
5.拖尾处理：–取适量拖尾液滴在盖玻片上。
–将染色好的血涂片倒置放在盖玻片上，使其与拖尾液接触。
–轻轻拖动血涂片，使细胞核进入拖尾液。
6.结果观察与分析：–将染色好的血涂片放置在显微镜下进行观察。
–分析细胞形态、染色程度等指标，记录结果。
注意事项•实验过程中需戴好实验手套，避免直接接触血液。
•制备血涂片时，务必将血液涂布均匀，以免影响结果。
•双氧水具有漂白作用，使用时需小心避免溅到衣物或皮肤上。
•染色剂使用过程中，应注意避免吸入或误食。
•结果分析时，应根据实验要求和标准参考范围进行判断。
结论通过本实验，我们成功制备了血涂片并进行了染色处理。
观察结果可为后续血液相关研究提供重要数据和参考。
在实验过程中，我们严格遵守实验室操作规程，并注意了安全事项。
希望本报告对今后的血涂片制备与染色实验有所帮助。
参考文献：无。
血涂片的制备及染色
图 １ 血涂片制备
·１６８·
２０ｍｉｎ，用热水将肥皂和血膜洗去，然后，用自来水对其反复
冲洗，擦干或烤干后备用。 取用载玻片时需用专用仪器，不
可用手接触玻片表面，以免污染玻片表面。 另外，还需对载
玻片两角作斜线标记，用剥离切割刀将载玻片两角裁去，制
成宽度约为 １５ｍｍ 的推片。
（ 二） 采血
准备好载玻片后，便可给受检者采血，可采用静脉采血
的着色效果较差。
（ 二） 姬姆萨染色法
姬姆萨染色法染色操作基本同瑞特染色法，不同的是其
采用的染料为姬姆萨染料，这是一种由天青和酸性染料伊红
组成的复合染料，可对细胞核结构和寄生虫进行良好的着
色，从而能清晰显示出这些物质的结构，但是，其对细胞质和
颗粒的着色效果较差。
（ 三） 瑞－姬染色法
瑞－姬染色法指的是将瑞氏染料与姬姆萨染料充分混
否存在血液疾病等，虽然该项检验技术在临床应用上极广，
但是，在实际检验过程中，受血涂片制备和染色不当等因素
的影响，常常会降低检验结果的准确性，从而会影响该项检
验技术的临床应用效果。 基于此，就需要检验人员掌握正确
的血涂片制备和染色方法。
一、 血涂片制备
（ 一） 载玻片和推片准备
一般需选用高纯度、耐腐蚀性强、抗水的玻璃制成的载
缘平滑的一端从血滴前方后移接触血液，使血滴沿推片边缘
展开，然后是推片与载玻片保持 ３０ ～ ４５° 夹角，平稳匀速地向
前推动，使血液沿推片散开，在载玻片上形成厚薄适宜、边缘
整齐的薄层血膜（ 边缘需留有一定的空隙） ，且还需保证血
涂片呈舌状，头体尾三部分明显，如图 １ 所示。
（ 四） 血涂片干燥
完成血涂片制备后，还需对其进行干燥处理，可采用空
血涂片制备与染色临床应用
血涂片制备与染色临床应用血涂片制备是临床实验室中常见的实验操作，用于观察和诊断患者的血液情况。
正确的血涂片制备与染色技术将有助于提高血涂片的质量，为临床医生提供准确的诊断信息。
本文将介绍血涂片制备的步骤以及常用的染色方法，并探讨其在临床应用中的意义。
一、血涂片制备步骤1. 准备工作：首先需要准备好检测所需的材料，包括玻璃片、无菌注射器、消毒酒精、无纺布等。
确保工作台面整洁，无尘无菌。
2. 采集血液样本：选择合适的采血部位，用无菌注射器采集血样，并将血样滴在玻璃片上。
3. 制备血涂片：将另一块玻璃片平行放在血样上，以45度角倾斜，缓慢向前移动，使血涂片的宽度均匀。
4. 干燥固定：将制备好的血涂片晾干，或者用火焰烘干，使细胞固定在玻璃片上。
5. 染色处理：根据需要选择合适的染色方法进行处理，使细胞核、胞质等结构清晰可见。
二、血涂片染色1. Giemsa染色：是血涂片最常用的染色方法之一，可用于观察红细胞形态、白细胞分类及寄生虫等。
染色时间和比例需控制好，避免染色过度或不足。
2. Wright染色：适用于白细胞分类和形态分析，特别是嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的染色效果较好。
3. 厌氧染色：用于观察寄生虫、真菌等微生物，需要较长的染色时间和特殊的操作条件。
三、血涂片在临床应用中的意义1. 诊断疾病：通过观察血涂片中各种细胞的数量、形态、分布等特征，可以帮助医生诊断贫血、感染、白血病等疾病。
2. 指导治疗：血涂片可以反映患者的血液情况，指导医生制定合理的治疗方案，监测治疗效果。
3. 预后评估：血涂片中某些指标的变化可以反映患者病情的进展和预后情况，有助于医生及时调整治疗策略。
综上所述，正确的血涂片制备与染色技术对于临床医学具有重要意义。
通过规范操作和严格控制，可以提高血涂片的质量，为临床诊断提供可靠的依据。
希望本文对于血涂片制备与染色临床应用有所帮助，谢谢！。
实验四静脉采血血涂片的制备与染色
取血
待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出， 勿挤。取干净载片，让血滴在离载片一端 中4～5毫米处，注意手指 持握载片的边缘 ，勿触及其表面。不能使载片接触取血部 位的皮肤。
推片 取一块边缘光滑的载片做推片。将其一
端置于血滴前方，向后移动到接触血滴， 使血液均匀分散在推片与载片的接触处。 然后使推片与载片呈30°～40°角，向另 一端平稳地推出。涂片推好后，迅速在空 气中挥干，使之自然干燥。
标记试管
在试管上贴上标签，著名患者姓名、项目名 称、采集日期、门诊或住院号。
消毒双手
采血前，操作人员应用肥皂或消毒液和水洗手。
选择静脉
采血前，要求受检者坐在实验台前。将前臂放在 实验台上，掌心向上，并在肘下放一枕垫。卧床 受检者要求前臂申展，暴露穿刺部位。常用采血 位置是肘前静脉，因其粗大、容易辨认。
检查注射器
静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固， 针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光 滑、通气，针筒不漏气。抽血时针栓只能向外抽 ，不能向静脉内推，以免形成空气栓塞，造成严 重后果。
扎压脉带
采静脉血时止血带压迫时间不能过长 、绑扎不能过紧，以避免淤血和血液浓缩 ，最好不超过1min，否则会影响某些试验 结果，如造成血红蛋白和血细胞比容增高 。
醇所固定;
3、 加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量 超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置5-10分钟;
4、 水洗、吸干、镜检。
血涂片染色
涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴 覆盖整个血膜1分钟
勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后将Ⅰ液和 Ⅱ液充分混匀静置10分钟
直接流水冲洗3-5分钟 （切勿先倒掉染液）
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血涂片制备与染色
血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。
血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。
血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。
（一）血涂片制备
1.载玻片的准备
新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。
旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。
使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。
2.血涂片制作方法
取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。
涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。
血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。
一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。
（二）血涂片染色
染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。
血涂片染色包括两个过程：固定和染色。
固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。
常用的染色方法有瑞特染色法（Wright）、姬姆萨染色法（Giemsa）等。
1.瑞特（Wright）染色法
为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。
血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。
目前常用瑞特染色法。
（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。
亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。
通常为氯盐，即氯化美蓝。
美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。
市售美蓝中部分已被氧化为天青。
伊红通常为钠盐。
即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。
（2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。
因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
（3）PH对细胞染色有影响。
细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。
因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。
配制瑞特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。
EAMGILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。
RA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。
Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm；天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。
所以新配染料RA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。
RA下降到1.3±0.1时即可使用。
瑞特染液贮存过程中，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。
有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，为了细胞染色清晰。
甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。
本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。
2.姬姆萨（Giemsa）染色法姬姆萨染料由天青和酸性染料伊红组成的复合染料。
染色原理、缓冲液与瑞特染色法大致相同。
本法对细胞核结构和寄生虫着色较好，结构显示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差。
3.瑞－姬染色法
瑞特染色液和姬姆萨染色液对细胞进行染色时有各自的显色特征，前者对细胞浆和颗粒着色较好，后者对对细胞核结构显示清晰。
因此将瑞特染料和姬姆萨染料混合，甲醇溶解后组成瑞－姬染色液能取长补短，优势互补，其中所使用的缓冲液与瑞特染色法相同。
用该混合染液对血细胞进行染色，细胞核、细胞浆和细胞内颗粒着色均有上佳表现，着色鲜艳，对比鲜明，是临床上广泛使用的方法。