血涂片和骨髓片的制备和瑞氏染色
实验五血涂片的制备和染色血细胞形态观察与血型鉴定
目的要求
学习掌握人血涂片制备和染色方法； 观察各种血细胞的形态。
实验材料
显微镜、载玻片、酒精棉球、采血针、 瑞氏染液
实验步骤
人血涂片的制备
一 次 推 成， 不 可 来 回 推！
实验步骤
血涂片的染色：瑞氏染色法
滴1-2滴甲液在血涂片上，盖满血片； 1min后滴加1.5倍的乙液，立即吹匀两液； 静置10～15min，用清水洗去染液； 干燥。
的血清中，混匀（每边各用一牙签，切勿混用）； 观察：室温下静置10min后，观察凝集现象。
A标准血清（抗B） B标准血清（抗A）
O A
B AB
实验结果
绘制各种血细胞图； 鉴定自己的血型； 讨论血液凝集的机理。
Ag type Ab type
实
B
验
原
理
A
None
ABO血型
A and B
实验原理
实 验 原 理
血液凝集
实验步骤
取一块清洁玻片，用记号笔在左上角写A， 右上角写B。
将A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，B型标 准血清（抗A）一滴加入右侧。
A标准血清（抗B） B标准血清（抗A）
实验步骤
采血：用75％酒精棉球消毒指尖，采血针采血； 取血：用两根牙签各取一小滴血分别放入载玻片
实验步骤 血细胞的观察：显微镜下观察各类血细胞
血涂片 红细胞
血小板
未成熟中性粒细胞
嗜酸性粒细胞
大淋巴细倍
（二）、血型鉴定
目的要求
学习ABO血型的鉴定方法； 观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型鉴定的
原理。
实验材料
显微镜、载玻片、酒精棉球、采血针、 A型和B型标准血清
实验四 血涂片的制备与染色
实验四血涂片的制备与染色【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。
【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。
用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。
细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。
【器材】1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。
2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。
3．吸耳球。
4．显微镜。
5．酒精灯或Bunsen灯。
6．采血针。
7．注射器和针头。
【试剂】1．瑞氏（Wright）染液（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。
将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。
再加15ml甘油密闭保存。
（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。
配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。
如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。
2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。
将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。
3．瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。
血涂片的制备及染色
血涂片的制备及染色摘要血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。
本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。
虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。
本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。
关键词：血涂片制备，染色前言血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。
虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。
本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。
本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。
显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。
列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。
发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。
这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。
为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。
血涂片制备载玻片载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。
典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。
荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。
最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。
这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。
在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。
载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。
血涂片的制备、染色、观察方法、复检
04
章节 PART
血涂片的复检
血涂片的复检
血涂片复检的意义，首先是复核该复检标本的血常规报告的准确性， 其次是在观察血细胞形态时，根据所观察到的外周血细胞形态，提供给临 床有效的信息，要做到保证血常规结果的准确、不漏检、不误诊、不误导。 切实的结合临床，关注已知的患者信息，查看患者的相关检查结果，了解
靠等待自然干燥章。节 PART
血涂片的染色
4、瑞氏染色是最经典，最常用的染色法，尤其对于细胞质成分，中 性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染 液对细胞核着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采
用瑞-姬姆萨章复节合染PA液R可T使细胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
患者出现的体章征节、P症A状R（T 必要时要询问临床医生），在此基础上，了解临
床医生的诊断或治疗思路，然后在显微镜下有目的地进行查找，才能做到 有百密而无一疏。
红系统细胞形态
一、正常红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
二、红细胞大小改变
章节 PART
红系统细胞形态
三、红细胞血红蛋白含量改变
章节 PART
章节 PART
红系统细胞形态
3、卡波环
章节 PART
红系统细胞形态
4、有核红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
5、网织红细胞：是指晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红 细胞之间的过度细胞，分为4型。Ⅰ型：丝球形，Ⅱ型：网型， Ⅲ型：破网型，Ⅳ型：点粒型（图2-165、2-166、2-167）
红系统细胞形态
章节 PART
血涂片的制备
二、将推片接近血滴处，然后轻轻接触血滴并压在血滴上，使血滴呈”一”字型展开, 充满推片宽度(如果能做到边缘血量较少,中间血量稍多为最佳)(图1-2,图1-3).
瑞氏染液制作血涂片
清洁液（洗液）重铬酸钾（工业品纯）300g浓硫酸（工业品纯）300ml自来水3000ml实际上重铬酸钾、硫酸和自来水之比为1：1:10。
先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓慢加入浓硫酸，边加边搅。
不准将水倒入浓硫酸内！！！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。
血涂片的制备：1、载玻片及盖玻片泡酸时间大于24小时，一张一张放，保证每一张都浸湿2、冲洗，先用自来水冲净至没有颜色，再用流水冲洗一夜3、放在95%的酒精中浸泡过夜4、取出后用棉布擦干，涂片，并用甲醇固定，竖直干燥。
Wright染色法制作血涂片1、取涂好的血片，用玻璃笔划出染色区，以防染液滴落后溢流。
2、将涂片平放桌上或者架上，滴加Wright染液至恰好布满所划范围的血膜，混动使混匀，染色约3分钟。
Wright染液配法:Wright粉剂0.1g，加甲醇60毫升。
将Wright粉剂放在乳钵内，充分研磨，越细越好。
然后取甲醇逐步加入乳钵内，边加边研磨，直至染料全部溶解，置试剂瓶中密封，以后走后可用，以放置一个月后再用最佳。
3、加入等量磷酸盐缓冲液（pH6.8~7)，不断晃动，染色约12分钟，直接放与流水下冲洗。
4、染色后甩干或者直立晾干，用中性树胶或者合成树脂或香柏油封片，或不封片直接镜检。
时间：温度较低时约15分钟（染3分钟，加缓冲液不断晃动12分钟。
温度较高时，总时间约5分钟。
剂量：染液与缓冲液剂量之比为1:1如果染色不够，蒸馏水冲洗后，在按照原步骤重新染封片：干燥后的血涂片，浸入二甲苯中后在其干燥前，擦去蜡线，滴明胶与血涂片的一边（半滴至一滴），眼科镊捏住盖玻片正面在酒精灯上烘烤一下后反面贴于载玻片上。
结果：红细胞呈橘红色；中性粒细胞颗粒蓝紫色至紫红色；嗜酸性粒细胞鲜红色至橘红色；嗜碱性粒细胞颗粒深蓝紫色；淋巴细胞核深蓝紫色，胞质天蓝色；单核细胞核蓝紫色，胞质灰蓝色。
、注：①Wright染料对pH较敏感，因此用缓冲液稀释染液，可使染色作用稳定，便于识别和比较细胞的变化。
血涂片的制备及染色
图 １ 血涂片制备
·１６８·
２０ｍｉｎ，用热水将肥皂和血膜洗去，然后，用自来水对其反复
冲洗，擦干或烤干后备用。 取用载玻片时需用专用仪器，不
可用手接触玻片表面，以免污染玻片表面。 另外，还需对载
玻片两角作斜线标记，用剥离切割刀将载玻片两角裁去，制
成宽度约为 １５ｍｍ 的推片。
（ 二） 采血
准备好载玻片后，便可给受检者采血，可采用静脉采血
的着色效果较差。
（ 二） 姬姆萨染色法
姬姆萨染色法染色操作基本同瑞特染色法，不同的是其
采用的染料为姬姆萨染料，这是一种由天青和酸性染料伊红
组成的复合染料，可对细胞核结构和寄生虫进行良好的着
色，从而能清晰显示出这些物质的结构，但是，其对细胞质和
颗粒的着色效果较差。
（ 三） 瑞－姬染色法
瑞－姬染色法指的是将瑞氏染料与姬姆萨染料充分混
否存在血液疾病等，虽然该项检验技术在临床应用上极广，
但是，在实际检验过程中，受血涂片制备和染色不当等因素
的影响，常常会降低检验结果的准确性，从而会影响该项检
验技术的临床应用效果。 基于此，就需要检验人员掌握正确
的血涂片制备和染色方法。
一、 血涂片制备
（ 一） 载玻片和推片准备
一般需选用高纯度、耐腐蚀性强、抗水的玻璃制成的载
缘平滑的一端从血滴前方后移接触血液，使血滴沿推片边缘
展开，然后是推片与载玻片保持 ３０ ～ ４５° 夹角，平稳匀速地向
前推动，使血液沿推片散开，在载玻片上形成厚薄适宜、边缘
整齐的薄层血膜（ 边缘需留有一定的空隙） ，且还需保证血
涂片呈舌状，头体尾三部分明显，如图 １ 所示。
（ 四） 血涂片干燥
完成血涂片制备后，还需对其进行干燥处理，可采用空
实验四静脉采血血涂片的制备与染色
取血
待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出， 勿挤。取干净载片，让血滴在离载片一端 中4～5毫米处，注意手指 持握载片的边缘 ，勿触及其表面。不能使载片接触取血部 位的皮肤。
推片 取一块边缘光滑的载片做推片。将其一
端置于血滴前方，向后移动到接触血滴， 使血液均匀分散在推片与载片的接触处。 然后使推片与载片呈30°～40°角，向另 一端平稳地推出。涂片推好后，迅速在空 气中挥干，使之自然干燥。
标记试管
在试管上贴上标签，著名患者姓名、项目名 称、采集日期、门诊或住院号。
消毒双手
采血前，操作人员应用肥皂或消毒液和水洗手。
选择静脉
采血前，要求受检者坐在实验台前。将前臂放在 实验台上，掌心向上，并在肘下放一枕垫。卧床 受检者要求前臂申展，暴露穿刺部位。常用采血 位置是肘前静脉，因其粗大、容易辨认。
检查注射器
静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固， 针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光 滑、通气，针筒不漏气。抽血时针栓只能向外抽 ，不能向静脉内推，以免形成空气栓塞，造成严 重后果。
扎压脉带
采静脉血时止血带压迫时间不能过长 、绑扎不能过紧，以避免淤血和血液浓缩 ，最好不超过1min，否则会影响某些试验 结果，如造成血红蛋白和血细胞比容增高 。
醇所固定;
3、 加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量 超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置5-10分钟;
4、 水洗、吸干、镜检。
血涂片染色
涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴 覆盖整个血膜1分钟
勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后将Ⅰ液和 Ⅱ液充分混匀静置10分钟
直接流水冲洗3-5分钟 （切勿先倒掉染液）
血涂片的制备和瑞氏染色
5、实验员作好有关实验记录。
前期准备
↓
采血
↓
干燥
↓
标记
↓
染色
↓
冲洗
↓
观察结果
↓
后期分析处理
6、冲洗：1分钟后，用流水冲去染液，待干。
7、观察结果：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体尾交界处的血细胞。
四、后期分析处理。
1、学生填写实验报告。
2、各组实验结果是否满意，分析造成偏差的原因。
3、器材由各组学生清洗完毕，实验员清点数目后放回准备室，打扫卫生，打扫完毕关闭门窗水电。
2、推片：左手平执载波片，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载波片呈30度到45度角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌、头、尾三部分。
3、干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。
4、标记：在载玻片的一端用记号笔编号。
5、染色：待血涂片干透后，将波片平置，滴加快速瑞氏染液数滴，使其快速盖满血涂片，
血涂片的制备和瑞氏染色
操作规程
操作流程
一、实验目的：
掌握血涂片的制备和染ห้องสมุดไป่ตู้的方法。
二、前期准备
1、抗凝血和快速瑞氏染液
2、学生分组（每二人一组）分放器材。毛细管、瑞氏染液、载波片、推片、纱布块、显微镜。
3、实验题目内容，操作步骤在黑板上写明。
三、步骤
1、采血：用微量吸管在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。
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大淋巴细胞
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呈圆形，直径13-18um。
胞核圆形或椭圆形，偏于一侧或着边。染 色质常质密呈块状，排列均匀，深染呈深 紫红色。
胞质丰富，呈透明天蓝色，可有少量大而 稀疏的嗜天青颗粒。
• 小淋巴细胞
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细胞呈圆形，直径10－15um。 胞核狭长，弯曲呈带状，两端钝圆。核染色质
粗糙呈块状，染深紫红色。 胞质中含特异性颗粒的不同，也可分为中性、
嗜酸性、嗜碱性杆状核粒细胞三种，颗粒特点 同中幼粒细胞。
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中性分叶核细胞
细胞呈圆形，直径10－15um。 胞核常分为2－5叶，以分3叶者多见，叶
血针、玻片、酒精棉光学显微镜、香柏油、 二甲苯、一次性采血针
四、方法
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㈠ 血涂片的制作
⒈ 采血：每组两个同学，练习耳垂采血（包括消 毒、扎针、挤压、取血），用推片取血液一滴， 于玻片右端，从其右侧接触血液，使之成40度角， 均匀平稳地向左侧推进，，至血滴推尽为止，其 厚度要适中，且有头体尾之分。
与叶之间有细丝状相连或完全断开，核 染色质浓集或呈小块状，染深紫红色。 胞质丰富，呈淡红色，布满细小紫红色 的中性颗粒。
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嗜酸粒细胞
嗜酸粒细胞胞体直径11－16um， 胞核多分为近似对称的两叶。 胞质中充密集粗大、大小均匀的桔红色嗜酸
• 圆形或不规则形，直径12-20um，边缘常见伪足 突出。
• 胞核形状不规则，常呈肾形、马蹄形、笔架形、 “S”形等，并有明显扭曲折叠。染色质疏松细致， 呈淡紫红色丝网状。
• 胞质丰富，呈淡灰蓝色或淡粉红色，可见多数细 小、分布均匀、细尘样淡紫红色颗粒。
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⒉ 待血片干后，滴加瑞氏染液数滴（盖住血膜）， 静置40 秒，加缓冲液等量混匀，染10~20分钟， 用水冲洗，干燥后镜检。
⒊ 镜检计数：在血膜头尾交界处，计数100个白 细胞，并对其进行分类。
㈡
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骨髓片的制备
⒈ 将临床医生所取骨髓至玻片高端（在准备涂片 时，将两玻片倾斜放置），使过多血液流下。
性颗粒。
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嗜碱性粒细胞
嗜碱性粒细胞胞体直径10-12um 胞核分叶不明显，或融合呈堆集状。 胞质中有稀疏的大小不一、分布不均、呈紫
黑色的嗜碱性颗粒，颗粒常掩盖在核上，致 使核的轮廓和结构模糊不清。
• 呈圆形或椭圆形，直径6-10um • 胞核圆形或椭圆形，或有切迹，核着边，染色质
粗糙致密，呈大块状，染深紫红色。 • 胞质量极少，仅在核的一侧见到少量淡蓝色胞质，
有时几乎不见而似裸核，一般无颗粒。
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单核细胞 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 (Monocyte)
血 小板
直径2-5um ，约为成熟红细胞的1/4--3/4 ，类圆形，星形与不规则形，淡红色，无 核。
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成熟红细胞
正常形态呈双凹盘形，直径7.5um，瑞氏染色为 红色中心稍淡染
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⒉ 蘸取骨髓适量（选择骨髓小粒部分），以 30~45度角，用力推开，速度适宜。然后将玻片于 空中挥动，使之干燥，以免细胞缩小或细胞皱缩。
⒊ 骨髓片制备好后，用标记笔在膜的头部注明病 人的姓名、取材部位及穿刺部位。
五、结果 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
杆状核粒细胞 (Stab Granulocyte)
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一、目的
掌握血涂片、骨髓涂片的制作及染色技术。 鉴别外周血中各种白细胞的形态特点及分 类计数方法。
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二、原理
瑞氏染液是由伊红美兰所组成的复合物， 经物理吸附及化学作用对细胞进行染色。
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三、材料