对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱
反相高效液相色谱法分离分析酯类混合物实验报告
反相高效液相色谱法分离分析酯类混合物实验报告
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是一种常用的酯类混合物的分离和分析方法。
以下是一份可能的酯类混合物分离实验报告：
一、实验目的
通过RP-HPLC方法对酯类混合物进行分离和分析。
二、实验原理
RP-HPLC是一种以氢键为主的静相色谱分离技术，适用于分离极性化合物。
对于酯类混合物的分离，采用C18静相色谱柱，以水和有机溶剂混合的流动相进行梯度洗脱，使不同极性的酯类在不同时间内出峰，从而得到纯净的目标酯类。
三、实验步骤
1. 准备样品
将酯类混合物称取 10 mg，溶解于 10 mL 甲醇中，摇匀并过滤得到样品。
2. 准备流动相
以甲酸为 pH 调节剂，加入适量的乙腈，稀释峰前或峰后的混合物，调节 pH 值，加入少量离子对阴离子等物质作为流动相。
3. 调整实验参数
将前体混合物进样器，选择 RP-HPLC 波长进行检测，调整流速为 1 mL/min，小球填充压力 15000 psi。
4. 进行分离分析
将前体混合物注入色谱柱，进行梯度洗脱，收集样品，测定各组分的峰面积。
四、实验结果
经过 RP-HPLC 的分离和分析，可以得到一组明显的峰，代表不同极性的酯类组分。
根据峰面积计算出各个组分的相对含量，并进行定量分析。
五、实验结论
通过反相高效液相色谱法分离和分析酯类混合物，可以得到纯净的目标酯类，为化学分析和应用提供基础数据和参考参量。
用高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸酯类含量
１ ２ ７ 标 准工作溶液 ：分别 吸取 上述 贮备液 １ ｍ ，用 ５ ％乙醇溶液 ．． ＯＬ ０
定容至 １ Ｏ Ｌ，此溶液浓度 为 １ ０ １ ｇ ｍ 。再分别吸取 ０ Ｏｍ Ｏ ／ Ｌ ２ 、５ ０ １ 、 、１ 、 ５ ２ｍ ０ Ｌ，用 ５ ％乙醇 溶液 定容至 １ Ｏ Ｌ，标 准工作溶液浓 度分别为 ０ ０ ０ｍ 、５ 、
维普资讯
趁 验 方 法
紫 定
甲
的
类
效 液相 色谱 法 测定
基 苯 甲 酸 酯 类 合 星
口 陈枚 刘 洋 ／ 文
对 羟 基 苯 甲 酸 酯 即 尼 泊 金 酯 ， 主 要 品 种 有 对 羟 基 苯 甲酸 甲酯 、对 羟 基 苯 甲酸 乙酯 、 １ 实 验 部 分 ． １ １ 方 法 ．
优级纯
１２ ２ 乙醇溶液 ５ ％ ．． ０
Ｈ Ｌ ＰＣ
费 时 ，且 样 品 处理 不 当 ，对 羟 基 苯 甲酸 酯就 不 能 被 完 全 提 取 ，影 响 检 测 结 果 的准 确 性 。
另外 ，该 方法 采 用 气相 色 谱 法 ， 仪器 条 件较
１ ２ ４ 盐酸溶 液 １ ．． ：１ １ ． 标准物质 ：对 羟基苯 甲酸 乙酯 、对 羟基苯 甲酸丙酯 ；纯度 ≥ ２ ５
１４ 样 品处 理 ．
次取平均值 。 以对羟 基苯 甲酸酯浓度 为横
坐 标 ， 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 ， 得 对 羟 基 苯 甲
酸 乙酯回归方程为 ｙ Ｏ ０ ８ ６ 一 ． ２ ，其 ＝ ．０９ ｘ０４ ２
相 关系 数 为 ０ ９ ９ 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 回 归 ．９８ 方 程 为 ｙ Ｏ ０ ９ ５ 一 ． ９ ，其 相 关 系 数 为 ＝．０ ７ｘ０ ３５
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
保留时间tR，并填于下表中：
组分名称 保留时间tR /min
3 ．测量未知试样色谱图上各组分的峰高 h ，半峰宽 Y1/2 ， 计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：
出峰 顺序 组分 峰高 h/mm 半峰宽 Y1/2/mm 峰面积 含量 w i%
A
103.6 注意事项
（1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成
作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保 持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分 保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照， 即可确定未知物中各组分存在与否。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计 算公式，与气相色谱分析法相同。而对羟基苯甲酸酯类 混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它 们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，可用下式：
wi
ห้องสมุดไป่ตู้Ai
A
i 1
n
100 %
i
103.3 实验条件
溶液的配制
(1)标准贮备液：
配制浓度均为1000 μ g·mL-1的上 述四种酯类化合物的甲醇溶液
四只100 mL容 量瓶
(2)标准操作液：
上述四种 标准贮备液 配制浓度均为10μ g·mL-1的 四种酯类化合物的甲醇溶液 四只10 mL容 量瓶
（3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱
气对实验有何妨碍？
103.8 参考答案
（1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点 ?本
实验为什么可以不用相对质量校正因子?
答：归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件 如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中 的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为 同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测方法
实验四高效液相色谱法检测食品中对羟基苯甲酸酯类苯甲酸、山梨酸和对羟基苯甲酸酯类是食品中常用的防腐剂，广泛存在于酱油、醋、化妆品中。
对羟基苯甲酸酯类有：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯。
它们对食品均有防止腐败的作用，苯甲酸的杀菌、抑菌效力随介质的酸度增高而增强，在碱性介质中则失去杀菌、抑菌效力。
山梨酸是使用最多的防腐剂，也是酸性防腐剂。
对羟基苯甲酸酯类以丁酯的防腐作用最好，由于对羟基苯甲酸酯类都难溶于水，所以通常是将它们先溶于乙酸、乙醇、乙腈等强极性溶液中，然后使用，为更好发挥防腐作用，最好是将两种或两种以上的该酯类混合使用。
虽然在限量范围内食用上述防腐剂对人体影响不大，但若大量摄入，则会危害人体健康。
各国都对食品中可以使用的防腐剂种类和用量有严格的要求，如中国的GB2760《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了使用范围和最大使用量。
不同商品中的最大限量：苯甲酸0.2-1g/kg（中），山梨酸0.2-1g/kg（中），甲酯1g/kg（中），乙酯0.1-0.25g/kg（中），丙酯0.012-0.2g/kg（中），丁酯0.25g/kg（日），异丁酯0.25g/kg（日）。
本方法可同时检测食品中上述8种防腐剂。
本实验检测溶液中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。
一、实验目的和要求1、学习高效液相色谱外标法定量定性分析方法；2、熟悉超高压液相色谱的分析操作规程；3、学习高效液相色谱检测食品中的防腐剂的方法。
二、实验原理在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸酯类，它们都是强极性化合物，可采用高效液相色谱进行分析。
以对羟基苯甲酸酯类标样保留时间定性，采用外标法定量对羟基苯甲酸酯类含量。
X=(A2×C)/A1（为样品中对羟基苯甲酸酯类的含量单位为ug/mL，单位；A1为标样对羟基苯甲酸酯类的峰面积；A2为样品中对羟基苯甲酸酯类峰面积；C为对羟基苯甲酸酯类标准液质量浓度。
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测
食品中对羟基苯甲酸酯类的检测摘要：文章采用超声提取-高效液相色谱法同时测定食品中3种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯）含量的方法。
对羟基苯甲酸酯类属于防腐剂，按gb/t5009.31-2003国家推荐方法检测[1]，样品提取比较繁琐、费时，且回收效果欠佳。
本文利用较为常见的紫外检测器通过优化条件，摸索出一个简捷、快速、经济、灵敏，又能保证一定精度的测定方法。
本方法加标回收率在86.08%～112.71%之间，线性系数r>0.9998，检出限可达0.10ug/ml，分析时间短，完全能够满足分析要求，可广泛应用于食品中对羟基苯甲酸酯类检测分析。
关键词：对羟基苯甲酸酯类；高效液相色谱法中图分类号：o657.7+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-10-0064-21 实验部分1.1 仪器和试剂1.1.1 仪器 shimadzu lc 10vp plus高效液相色谱系统（日本shimadzu公司），配紫外检测器及lc solution色谱工作站；分析天平：感量0.1mg；氮吹仪：美国organomation n-evap112型；均质机：ikar werke t25型均质机；溶剂过滤装置；0.45μm和0.22μm过滤膜和过滤头；milli-q超纯水机。
1.1.2 试剂甲醇、乙腈为hplc级；乙醇为分析纯；水为超纯水。
标准品：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯，纯度为99.0%，美国进口，购于上海安谱。
1.2 标准溶液的配制[2]标准贮备液：精密称取三种标准物质0.05g，用无水乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，配制成浓度为1mg/ml的标准贮备液，贮于4℃冰箱中备用。
标准使用液：用刻度吸管准确吸取三种标准贮备液，根据需要用无水乙醇配制成不同浓度的标准溶液系列，待用。
1.3 色谱条件色谱柱：diamonsil c18，粒度5μm，4.6mm×250mm（id×l）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：20 μl；流动相：水-乙腈（体积比为45：55）；柱温：室温。
高效液相色谱法测定酱腌菜中对羟基苯甲酸酯
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ —ｈｙ ｄｒ ０ ｘ ｙ ｂ ｅ ｎｚ ０ ｉ ｃ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｓ
ｉ ｎ ｐ ｉ ｃ ｋ ｌ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ａ ｕ ｅ ｒ ｋ ｒ ａ ｕ ｔ ｓ ｂ ｙ ＨＰ ＬＣ
ＺＨＡＯ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ—ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ Ｃｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ，Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ ，Ｈｅ ｎ ａ ｎ ４ ６ ６ ０ ０ ０，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
摘要： 目的 建立高效液相色谱法测定酱腌菜中对羟基苯甲酸酯的检测方法。方法 样品经酸化 、 甲醇 一 水溶
液提取 ， 采用 高效 液相 色 谱 仪 Ｃ １ ８柱 分离 ， 紫 外 检 测器 测 定 。结果 标 准 曲 线线 性 范 围 ： ２ ． ０～ｌ Ｏ ０ ￣ ｇ ／ ｍ ｌ ， ｒ ：
ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｒ ｅ ｖ ｅ ａ ｌ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗ ａ ｓ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ， ｒ ａ ｐ ｉ ｄ， ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｌ Ｏ Ｗ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ， ｉ ｔ ｗ ａ ｓ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｏｒ ｆ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ －
对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
大
学
3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，
通 用
计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：
化 学
实
验
出峰 顺序
组分
峰高
h/mm
半峰宽
Y1/2/mm
峰面积
A
含量
wi%
技 术
7/13
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
对 反羟 相基 高苯 效甲 液酸 相酯 色类 谱混 分合 析物
的
大
学
通
103.6 注意事项
用
化
（1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成 学
实
仪器损坏。
验
技
（2）流动相使用前应用微滤膜过滤并充分脱气。
术
（3）样品溶液若不清澈透明，应用微滤膜过滤。
8/13
（4）实验结束后，应冲洗色谱柱30 min以上。
对 反羟
相基
高苯
效甲
液酸
相酯
色类
谱混
分合
析物
的
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
四只10 mL容 量瓶
混匀 备用
对 反羟 相基 高苯 效甲 液酸 相酯 色类 谱混 分合 析物
的
大
色谱条件：
学
(1)色谱柱
长25 cm、内径3 mm 装填C-18烷基键合相
通 用 化
粒度为10 μm的固定相
学
实
验
(2)流动相
甲醇︰水=55︰45流量
技
1 mL·min-1
术
4/13
(3)检测器
紫外光度检测器检测波长
的
在线答疑： wy-fxhx@ lhfdlx@
食品中对羟基苯甲酸酯类的测定 高效液相色谱法
食品中对羟基苯甲酸酯类的测定高效液相色谱法1 范围本标准适用于酱油、醋、果酱、糕点、腌制品、果酒及饮料等食品中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
本标准检出限：对羟基苯甲酸甲酯：1.8 mg/kg；对羟基苯甲酸乙酯：1.2 mg/kg；对羟基苯甲酸丙酯：0.9 mg/kg；对羟基苯甲酸丁酯：1.3 mg/kg。
2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 原理试样用乙醇超声波提取，取上清液过滤，以高效液相色谱法分离，二极管或紫外检测器检测，外标法定量。
4 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇（色谱纯）。
4.2 乙酸铵（分析纯）。
4.3 20 mmol/L乙酸铵溶液：准确称取1.54 g乙酸铵（4.2）用水定容至1000 ml，过0.45μm 滤膜。
4.4 无水乙醇（分析纯）。
4.5 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯：99 %以上。
4.6 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准储备溶液：准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯各0.050 g于50 mL容量瓶中，用甲醇（4.1）稀释至刻度，该溶液每毫升相当于1 mg的对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
4.7 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准工作溶液：将混合标准溶液用甲醇（4.1）依次稀释成1.0 μg/ml、10.0 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml的系列标准溶液，使用前配制。
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对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱
一目的要求：
1 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；
2 熟悉高效液相色谱仪的结构；
3 熟悉高效液相色谱分析操作（流动相的设置、检测波长的设置、运行时间设置、保留时间和峰面积的获取）。
二基本原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。
这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：
对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，故上式可简化为：
三实验主要仪器和试剂
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器，色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm）
试剂：1．对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯；二次蒸馏水
标准溶液的配制：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯用甲醇作溶剂分别配制成1000μg/mL标准贮备液；用甲醇稀释成10μg/ml标准工作液；标准混合工作液分别含四种酯类化合物10μg/mL的甲醇溶液。
（浓度仅供参考，记录实验中具体使用的浓度）
四实验条件（3、4、5仅供参考，记录实验中具体的操作条件）
1．色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），
2．检测器：紫外光度检测器，检测波长254nm
3．流动相：甲醇：水(Ｖ１：V2)，流量1mL/min（以在混合试样中能分开）
4．进样量：5μL
5．柱温：30℃
五、实验步骤
1．在淋洗瓶中装入足够量的甲醇和水，分别脱气5min；
2．根据实验条件，设定各操作条件的参数，然后开始走基线，待仪器液路和电路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。
3．依次分别吸取5 L的四种标准工作液及标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复1次。
在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。
六数据记录及处理
1．记录实验条件
(1) 色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm），
(2) 流动相：
(3) 检测器：
(4) 进样量：
(5) 柱温：
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间t R，并填于下表1。
表1 四种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间
3．依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间t R（min）值，并填入表2，然后与上表中h值对照，确定各色谱峰代表何种化合物。
表2 未知试样色谱图
七思考题
1．归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？
2．在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗?
3．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。
4. 本实验中怎样调整流动相的比例改变保留时间，举例说明。