抗体酶及其应用
抗体酶的研究及其应用
抗体酶的研究及其应用郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：抗体酶又称催化性抗体，是具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，它可促进许多用普通化学方法很难完成，或者天然酶尚未能催化的新奇转变，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
本文就催化抗体的结构、性质、产生方法、筛选方法、酶学特征及应用进行了综述。
关键词：抗体酶；催化；高度选择性；催化剂；实用价值；结构抗体酶是具有催化性质的抗体。
从1883年Payen和Personz发现第一个酶以来，自从1986年Schultz和Lerner首次证实由过渡态类似物为半抗原，通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性以来，直至20世纪80年代初期，整整一个半世纪，发现的酶已经超过了4000种[1]。
1986年，Schultz和Lerner 同时在《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。
Abzyme本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体。
酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。
抗体酶显示出在许多领域的潜在应用价值，包括许多困难和能量不利的有机合成反应，前药设计，临床治疗，材料科学等多个方面。
抗体酶这种兼具抗体和酶的性质的崭新物质，它集生物学、免疫学、化学于一身，它的发现打破了只有天然酶才有的分子识别和加速催化反应的传统观念，为酶工程学开创了新的领域，同时也为验证天然酶的催化机制，进行酶的人工摸拟，以及研究天然酶催化作用的起源提供了很好的帮助。
抗体酶的应用前景是十分广阔又充满希望的。
1.抗体酶的发展历史抗体酶(abzyme),又称催化抗体(catalytic antibody),是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体,它既具有相应的免疫活性,又能像酶那样催化某种化学反应[2]。
抗体酶的制备及应用
Ｃ ｉ ａ ｓ ｉ ｉ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｏｇ ｅ ｅ ｈ ｎ ｃ ｅ １ ｎ ｅ ｈ ｏ］ ｙ Ｒ ｖｉ ｗ ｃ●Ｉ 源自抗体 酶 的制 备及 应 用
吕璨 慧
（ 国矿 业 大学 中
温
哲
徐州 ２１ １ ） ２ １６
江苏
Ｉ Ｎ 要】 体酶 既 具有相 应 的免 疫活 性， 抗 又具有 生 物催 化活 性 。抗体 酶具 有 抗体 种类 繁 多， 但 能催化 一 些天 然酶 能 催化 的反 应， 不 而且 还能 催化 一些 天然 酶不 能催化 的反 应等优 点 ，因此 在有 机合 成 、医 学、戒 毒 、前 药生产 等领 域 都有着 广泛 的利 用 。本文主 要 就抗 体酶 的催 化机 理、制 备方法 、具 体应用 等几 方面 展开讨 论 。 ［ 关键 词】 体酶 制 备方 法 抗 中图分 类号 ：９ ２ Ｒ ７ 应用 文 献标 识码 ： Ａ
的催化性抗 体 。 ３ 抗 体酶 的 应 用 口 ２ １ ３ １ 在 有机合 成领 域 的应用 ．
１抗体 一发 晨 历程 【 １ 】 １８ ９ ４年列 那 （ ｅｎ ｒ 进一 步推 测 ：以过渡 态类 似 物作 为半 抗 原，则 其 Ｌｒ ｅ） 诱发 出 的抗体 即与该 类似 物有 着互 补 的构象 ，这种 抗体 与底 物结 合后 ，即 可 诱导底 物进 入过 渡态 构象 ，从 而引起 催 化作用 。根据 这 个猜想 列那 和 苏尔滋 （． ． ｃｕ ｔ） Ｐ Ｃ Ｓｈ ｌ ｚ 分别领 导各 自的研究 小组 独立 地证 明 了：针对 羧酸 酯水 解 的 过渡态 类似 物产 生 的抗体 ，能催 化相 应 的羧酸 酯和碳 酸 酯 的水 解 反应 。１８ ９６ 年美 国 Ｓ ｉｎ ｅ ｃ ｅ ｃ 杂志 同时发 表 了他们 的发 现 ，并将这 类 具催化 能力 的免 疫球 蛋 白称 为 抗体 酶 或 催 化 抗体 。 ２抗体 群的 村 鲁方 法 ２ １ 杂交癌 技术 ［ ． ５ 杂交 瘤技术 的基 本原 理是 用不 能在培 养液 中 生长的但 能产 生抗 体 的脾脏 细胞 ，与能 在培养 液 中生长 的骨髓 瘤 细胞进 行 融合 ，融合 得到 的杂 交细胞 既 能产生 抗体 又能在 体外 培养 ，通过 选择 培养 ， 以获取 能产 生单 克隆 抗体 的杂 交 瘤细 胞 。 再把 这些 细胞 单克 隆化 ， 即繁殖 成母 体 的同一 细胞 或形 成菌 落 。 这 些 菌落 能够产 生单 一均匀 的 抗体 ，可用 于进 行单 克隆 抗体 的扩 大生 产 。对 这 些菌 落用 酶联免 疫 吸附法 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 等方 法加 以筛选 。 该制备 方法 的关 键是 要有 合 适而 稳定 的过 渡态 模拟 物 作半 抗 原 ，以产 生与过 渡 态 高度 亲和 的抗 体 酶 。 由于大 多数反应 过 渡态类 似物 的分 子量 较低 ， 即所谓 的半 抗原 ，他们 本身 免 疫 原性很 弱 ，必须 与某种 载体 偶联 才能 表现 免疫 原性 。本方 法所 得到 的抗 体 酶 的催 化 能 力 的 高低 ，在 很 大 程度 上 取 决 于 化 学模 型 物 的 设 计 。 ２ ２ 抗体 结合 部位 修饰 法 ． 将 催化 基 团或辅 助因子 引入 到抗 体 的抗 原 结合 部位 ，一 般可采 用 两种 方 法： 即选择 性 化学 修饰 法 和 基 因工程 定 点 突变 法 。 （） １化学 修饰法 抗 体酶 可 以用 化 学修饰 的方法 加 以改造 。 抗 体酶进 行 结构修 饰 的关键 对 是找到一 种吻合 的方法 在抗体 结合 位置或 附近 引入酶 的催化 基 团或辅助基 团， 如果引人的催化基 团与底物结合部位取向正确空间排布恰到好处，就能产生 高活力 的抗 体酶 。 为提 高抗 体酶 的催 化能 力 ， 可采用 邻 近效应 ， 电催化 ， 静 应 变 ，功 能 团催 化 等 方 法 ，在 抗 体 结 合 位 点 引 入 催 化 基 团 。
抗体酶
抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去 设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计 制作酶。它是酶工程的一个全新领域。利用动 物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到 一系列高度专一性的抗体酶，使抗体酶不断丰 富。随之出现大量针对性强、药效高的药物。 立体专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体 专一性的药物成为现实。以某个生化反应的过 渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶， 以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可 有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防 止病毒与靶细胞结合。抗体酶的固定化已获得 成功，将大大地推进工业化进程。
其它名称 反应可逆 二烯合成 [4+2]环加成 二烯 dienes 亲二烯体 dienophiles
环己烯衍生物
R
O C R(H) W CO2R(H) CN NO2
（吸电子基）
有利因素:
G
OR NHR
（给电子基）
Diels-Alder反应机理
G W + G G
六员环过渡态 协同机理
G
G W
W
2、抗体结合位点化学修饰法： 抗体酶和酶一样也可以用化学修 饰法加以改造。对抗体酶进行结 构修饰的关键是找到一种温和的 方法在抗体结合位置或附近引入 具有催化功能的基团。游离巯基 就是适合的基团之一，它具有高 亲核性，易于氧化，及能通过二 硫化物进行交换反应或亲电反应 而选择性修饰的特点
3 . 引入辅助因子法
结果按这种设想所得到的抗体不仅使酯 的水解速度增加了103～104倍，而且还具 备专一性、 pH依赖性及被抑制剂抑制等 酶的基本特性。抗体酶的催化活性虽然 仍比天然酶小，但这意味着可按人的意 愿来设计和生产具有已知结合专一性的 蛋白质，在理论上和实践上均有重要意 义。美国已将抗体酶技术商品化，在第 一批具有应用价值的抗体酶中有与蛋白 酶相似的抗体，可在特定的氨基酸序列 上切割蛋白质，从而建立具有各种专一 性的切割蛋白质抗体酶库，就像限制性 核酸内切酶库一样供研究者选用。
抗体酶
制备方法
• 1、杂交瘤技术 • 经体内免疫后再进行细胞融合是制备抗体酶的一种传统方法。 杂交瘤技术的基本原理是用不能在培养液中生长的但能产生抗 体的脾脏细胞，与能在培养液中生长的骨髓瘤细胞进行融合， 融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养，通过选择 培养，以获取能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。再把这些细胞 单克隆化，即繁殖成母体的同一细胞或形成菌落。这些菌落能 够产生单一均匀的抗体，可用于进行单克隆抗体的扩大生产。 对这些菌落用酶联免疫吸附法等方法加以筛选。该制备方法的 关键是要有合适而稳定的过渡态模拟物作半抗原，以产生与过 渡态高度亲和的抗体酶。由于大多数反应过渡态类似物的分子 量较低，即所谓的半抗原，他们本身免疫原性很弱，必须与某 种载体偶联才能表现免疫原性。本方法所得到的抗体酶的催化 能力的高低，在很大程度上取决于化学模型物的设计，现在应 用的设计策略包括：诱导和转化设计，反应免疫，“潜过渡态” 半抗原设计等等。
• 2、抗体结合部位修饰法 • 将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，一 般可采用两种方法：即选择性化学修饰法和基因工程定 点突变法。抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加 以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键，是找到一种吻 合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基 空间排布恰到好处，就能产生高活力的抗体酶。为提高 抗体酶的催化能力，可采用邻近效应，静电催化，应变， 功能团催化等方法，在抗体结合位点引入催化基团。基 因工程定点突变法是利用位点专一性突变引起抗体结合 部位氨基酸的改变，能在抗体结合部位换上有催化作用 的氨基酸，进而改变抗体酶的催化效率。目前，定点突 变的方法己成为提高抗体酶活性的一种常规方法。
• 3、克隆免疫反应因子的基因 • 通过PCR技术克隆出全套免疫球蛋白的可变位点 使它们随机地将基因的轻重链结合，这些含上利用了免疫因子的多样性， 通过这种方法我们可从上百万种可能性中选择 抗体酶。[1]
抗体酶
抗体酶综述陈璇【摘要】抗体酶是一类以过渡态类似物，为半抗原，可诱导免疫系统产生具有类似天然酶催化活性的免疫球蛋白。
抗体酶既具有抗体的高效选择性，又能像酶那样高效催化化学反应，开创了催化剂研究的崭新领域。
本文从抗体酶的发展历史、作用原理、制备、应用及研究展望多个角度进行综述。
【关键词】抗体酶；发现史；作用原理；制备；现状及应用前景抗体酶抗体酶(abzyme)，又称催化抗体(cat·alytic antibody)，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应。
抗体与酶相似，它们都是蛋白质分子．酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能态的过渡态分子相结合，而抗体则与抗原(基态分子)相结合。
抗体与天然酶相比，最大的优点在于抗体的种类是巨大的，免疫系统可以拥有10 种抗原特异性不同的抗体分子。
制备成功的抗体酶不但能催化一些天然酶能催化的反应，而且还能催化一些天然酶不能催化的反应。
抗体酶的发现早在l948年，美国斯坦福大学荣誉退休化学教授l』_波林(LinusPaulin'f)就提出过渡态理论(transition state theory) [2]。
这一理论认为，酶之所以具有催化能力，是因为它与反应分子(底物)的牢固结合的方式，有利于反应中的过渡态(transition state)的结构。
而这种结构会迅速重新排列成该反应的产物。
任何有利于过渡态，而不是其它可能的结构的因素，都能加快化学反应速度。
1 969年，布兰戴斯大学生物化学家w ·詹克斯(w ·Jenks)进一步发展了这一理论。
他和几位美国科学家认为，如果波林的观点是正确的话，那么利用某一反应过渡态的模拟物作为免疫原，则会得到催化该反应的抗体。
这种抗体能特异地识别化学反应的过渡态，并利用其结合能降低反应的活化能。
抗体酶及其应用2016年
抗体酶及其应用左摘要：抗体酶（abzyme），又叫催化抗体（catalytic antib）,是具有催化活性的免疫球蛋白。
自1986年成功获得抗体酶后，相关研究激增。
但由于抗体酶的催化效率低，制备困难，研究热情渐渐消退。
一开始的研究目的主要是工业应用，但抗体酶催化效率太低而放弃了。
现有的研究主要集中在抗体酶在临床医学方面的应用，因其具有高特异性、长半衰期、低免疫源性和高可塑性。
关键词:抗体酶催化抗体免疫球蛋白1.抗体酶的出现抗体酶就是有催化活性的抗体。
抗体指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
鲍林(Pauling) 在1946 年用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。
1984年Lerner设想可以通过对过渡态类似物产生抗体，抗体会诱导底物进入过渡态，使反应进行。
根据这个设想，Lener和P. C. Schultz分别独立地证明：对所酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体有催化相应羧酸酯和碳酸酯的反应。
这种有催化活性的抗体被命名为抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalyticantibody）。
2.抗体酶的制备我们简单地把抗体酶的制备分为生物学方法和化学方法(Figure 1)。
Figure 1抗体酶制备化学方法就是设计反应的过渡态类似物，把类似物作为半抗原，连接到恰当的载体上，形成抗原，通过动物免疫作用产生抗体，再筛选。
生物学方法主要有两种，一种是用酶做抗原，筛选出与酶特异性结合的抗体，用该抗体作为抗原，再产生能和底物过渡态结合的抗体。
相当于把酶拷贝了一份。
所以又称之为拷贝法。
另一种是用酶的抑制剂做抗原，产生的抗体可能和底物结合。
另外还有一些方法，如定点突变蛋白设计抗体；化学修饰抗体；抗体基因组合文库法等等。
3.抗体酶的应用随着研究的深入，尽管抗体酶的催化效率(k cat/K M)不断提高，但是抗体酶的催化效率（102-104 M-1s-1）远低于天然酶（106-108 M-1s-1）（Xu et al. 2004; Rao and Wootla2007）。
抗体酶及其应用
抗体酶是具有催化性质的抗体，它同时具备抗体和酶的特征，可催化多种化学反应，如酰基转移、酯水解、酰胺水解、重排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。
用人工方法合成的抗体酶，可作为研究酶作用机理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应，更为开发具有高度选择性的药物指明了方向。
本文对抗体酶的研究开发思路和历史、催化反应类型、制备方法及发展前景作了综述。
关键词抗体酶过渡态类似物催化反应抗体酶是具有催化性质的抗体。
1986年，Lerner和Schultz [1] 同时在美国《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。
Abzyme 本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalytic antibody）。
抗体有极高的亲和力，解离常数在10 ~10 mol/L，这与酶相似，但无催化活力。
酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。
抗体酶同时具备了抗体和酶的特征，应用前景十分广阔。
一、抗体酶设计的研究思路及历史过程1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。
他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。
这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10 ~10 s，实际中极难捕获。
同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。
既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物；还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。
抗体酶知识讲解
第七章 抗体酶 Chapter 7 Abzyme
第七章 抗体酶
一 概述 二 机制 三 制备 四 应用
一、抗体酶的发现与研究思路
酶的催化机理是降低活化能。
1946年,诺贝尔奖二次得主 美国化学家Linus Pauling 提 出酶催化反应的过渡态理论。
在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物 的实际上是底物形成的过渡状态，
基因工程的技术使得建立抗体基本的组合，并 根据需要构建适当序列的基因片段已成为可能。利用抗 体库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基 因工程构建的全新抗体酶。
（3） 拷贝法
用已知酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术， 制得抗该种酶的抗体。再以此种抗体免疫动物，再次采 用单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活 性的抗体酶(因为抗原与该抗产生的抗体具有互补性，经 过上述两次拷贝，就把酶的活性部位的信息翻录到抗体 酶上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应)。
寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体
可能具有酶活性
以稳定的过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补 构像的抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过 渡态，该抗体即有酶催化反应的基本特征，可能成为一种
具有酶活性的抗体。
半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不 能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原 性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
2、有更强的专一性和稳定性 抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的 分子
抗体酶催化反应的介质效应
酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。 脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。
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进展评述抗体酶及其应用杨玉社 胡增建 嵇汝运 陈凯先(中国科学院上海药物研究所200031)摘要 生物学家一项惊人的发现:人体防御体系的武装2抗体,也能象酶那样起作用,这些被称作抗体酶的研究成功将会引起21世纪生物技术的一场革命。
本文介绍抗体酶的结构、制备方法、催化特征、应用及其发展前景。
关键词 抗体酶 外酶 过渡态类似物 催化作用酶是自然界经过数百万年进化而发展出来的生物催化剂,它能在极其温和的条件下高效专一地催化某些化学反应。
所以对任何一个我们感兴趣的通常化学反应(如药物合成中的关键反应步骤)设计一种象酶那样的高效催化剂是科学家们梦寐以求的。
抗体酶研究成功[1,2]以来,科学家设计制造酶的梦想正在逐渐变成现实。
酶和抗体的本质差别在于酶是和反应过渡态(激发态分子)选择结合的催化物质而抗体是和基态分子选择结合的催化物质,它们识别底物的机理是相同的。
抗体的多样性赋予它几乎无限的识别能力。
如果能以激发态的分子为半抗原激发免疫系统产生抗体,那么这种抗体反过来可能催化经过此过渡态的化学反应。
但激发态的过渡态分子不可能作为抗原来产生抗体。
但对某一特定的酶催化的化学反应,人们可以合成一种稳定态的分子,它在带电性能,几何形状与反应过渡态分子结构类似,这种稳定态分子称为过渡态类似物。
用这种过渡态类似物作为半抗原,诱导产生抗体,这样产生的抗体又能识别反应过程中真正的过渡态,该抗体具有酶摧化反应的基本特征,可能成为一种具有酶活性的抗体。
自1986年抗体酶宣告成功一来,迄今为止抗体酶已成功地催化了所有六种酶促反应和数十种类型的常规反应。
这包括羧酸酯、碳酸酯、磷酯酯、肽键、烯醇醚和糖苷键的水解,酰胺的形成和水解,酯交换、内酯化、消除反应,C laisen重排反应:D iels2A lder反应、光分解和聚合、顺反异构化、脱羧、环氧化反应等[3]。
抗体酶在治疗方面也展现出灿烂的前景。
1 抗体的结构[4]抗体和酶一样是大分子蛋白质,由2条相同的轻链(大约2500D)和2条相同的重链(大约5000D)组成,见图1。
轻链由VL(可变区)和CL(不变区)组成,重链也由V H(可变区)和CH(不变区)组成。
重链和重链及重链和轻链之间通过二硫键相连。
此外重链还有一连接枢扭。
抗体的结合部位由6个超变区组成。
对同类型抗体CL和CH部分氨基酸的序列相同,然而VL和V H是非常专一的。
可变区大约由110个氨基酸组成,至少可产生108个不同抗体,它是抗体多样性的基础。
Fab片断由轻链和重链V H及CH1组成。
抗体2抗原复合物是借助范得华力,疏水作用,静电作用及氢键作用而形成。
杨玉社 男,34岁,博士,从事抗菌药物、抗肿瘤药物及相关领域研究。
1996211225收稿图12 抗体酶的产生方法211 细胞融合法[5]此方法是Schu ltz等首次使用的方法。
其过程如下:要得到一特定抗原的抗体,如果抗原是小分子,必须将其和载体蛋白相联。
然后对此抗原进行免疫,使宿主有机体针对抗原产生抗体,产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。
融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。
通过选择培养,杂交细胞得以存留。
将杂交体克隆化,即繁殖成母体的同一细胞或分离成菌落。
这些菌落能够产生单一均匀的抗体。
对这些菌落用酶联免疫吸收实验加以筛选,以评价其选择性结合抗原的能力。
然后把抗原结合到一种固体支撑物上,再加入含有抗体的介质,这样抗原2抗体复合物随即形成,经过提纯就得到AB2A G复合物。
212 抗体结合点位化学修饰法[4]抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。
对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。
游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性,易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。
Schu ltz等在IgAM O P315抗体结合部位选择性的引入了亲核性的巯基。
其方法如下:用含有易裂解键(如二硫键或硫键)的亲和力标记试剂,在N aCNBH3存在下,对抗体进行亲和力标记,将标记的抗体通过亲和力色谱而纯化,然后标记物被裂解形成活泼的二硫化物。
大量的催化基团能够通过二硫化物的交换反应而引入。
通过此方法,在IgAM O P315抗体的结合部位引入了巯基(2SH),其催化香豆酯水解的速度比照样相提高了6×104倍。
213 引入辅助因子法[6]很多天然酶活性中心都含有金属离子。
L erner等将金属离子引入抗体酶,成功地催化了肽键的选择性水解。
他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子,所用半抗原分子带有一肽键。
且通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连。
将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体,在金属离子复合物作为辅因子的参与下,这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键,其转化数达6×10-4。
214 用生物工程的方法产生抗体[7]生物工程用于抗体酶技术正在大大加速其研究进展。
Scri pp s研究院的研究人员开创了一项革命性的技术——在体外制造抗体片断即Fab片断。
Fab片断由轻链和重链的V H及CH1部分组成,作为一种催化剂,抗体酶有这样的片断就行,无须完整的抗体分子。
有了这种新技术,科学家们就无须在要得到一种新的抗体时,就要用抗原给老鼠注射一次,而是从人或动物的抗原中抽取基因,然后用酶反应复制基因的聚合酶链反应(PCR)技术重新铸造轻链和重链,这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。
这些基因库是存储在细菌病毒里,通过随机地将基因和轻重链结合的方法,就可大量制造Fab片断了。
片断里的基因是通过细菌的形式表达出来的。
这样就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体,将它们用于催化反应比使用老鼠杂交细胞更快更方便。
3 抗体酶的催化特征[8]311 动力学特征抗体酶催化反应和酶相似,包括抗体对底物的非共价键识别,然后将底物转化为产物,呈现饱和动力学特征并符合米氏动力学。
312 抗体催化反应的专一性另一个特征是催化反应具有专一性,包括区域及立体专一性。
313 催化抗体的熵陷阱催化抗体的另一特点是可以降低某些反应的熵势垒。
在诸如C laisen重排及D iels2A lder反应中,底物和抗体的结合能可用以冻结反应的平移,旋转等运动。
4 抗体酶的应用411 抗体酶在有机化学中的应用[9]41111 催化羧酸酯和碳酸酯水解[1,2]抗体酶催化的第一个反应是打破羧酸酯和碳酸酯中弱的碳氧键。
1986年L erner和Schu ltz独立地发表了他们关于抗体酶催化羧酸酯水解的第一篇报告。
羧酸酯和碳酸酯的水解是通过一个带负电的四面体过渡态完成的。
对应的磷酸酯是它们稳定的过渡态类似物,因此L erner 等合成了一系列磷酸酯作半抗原接上载体蛋白培养单克隆抗体。
如期所料,产生的抗体能催化羧酸酯和碳酸酯的水解,见图2。
抗体酶水解酯具有高度的立体专一性。
B enkovic和Schu ltz两小组将此方法用于产生抗体酶以水图2解那些不活泼的烷基酯。
他们发现有9种抗体催化(R)2苯基酯水解,而有两种抗体催化(S)2酯水解。
对其中两株抗体进行了深入研究,它们加速(R)2酯和(S)2酯水解的速度分别比背景实验快80万倍和1600倍,R S选择性大于98%。
图3图441112 催化消除反应及还原反应[10]Schu ltz利用电荷互补概念以7为抗原产生了结合位置有羧基负离子的抗体酶[4],此抗体酶具有适当排列的羧基负离子,能催化Β2氟代酮消除H F的反应。
他们用一个铵离子替换底物的可置换氢作为半抗原,产生的抗体大多能催化消除反应。
如所预料的那样,具有正电荷的抗原所诱导的抗体中其羧基负离子正好位于可置换的质子成键距离之内,此羧基负离子在生理pH之下是一种良好的碱,Pka=6.2。
同位素证明Β2氟代酮消除反应的rds为去质子步骤,见图4。
41113 内酯化反应[11]∆-羟基羧酸酯的分子内环化反应,也能用抗体酶催化。
用化合物8为半抗原(8为单一构型的立体异构体。
)培养单抗。
其中24B11抗体可催化∆2羟基内酯9的内酯化,而且显示出强的立体选择性。
24B11催化外消旋9环化反应,发现只有50%可被环化,其余50%还是未反应的9。
环化产物10具有很高的ee值,见图5。
41114 C laisen重排反应[12]分支羧盐转化为预苯羧盐是一个典型的生物C laisen重排,这是细菌,真菌,植物体内芳香氨基酸生物合成的关键一步,由分支羧盐变位酶催化。
此反应可用抗体酶催化,反应通过一不对称椅式过渡态。
用过渡态类似物培养抗体,产生的抗体酶催化此反应的效率比天然酶高数百万倍,抗体催化此反应的活化熵为零。
相比之下,无催化剂时该反应的熵为213单位,证明熵陷阱在此反应中的重要性。
同时抗体酶只催化(2)2分支羧盐的C laisen重排,见图6。
图641115 催化D iels2A lder反应[5]D iels2A lder反应出现一个高度有序的过渡态,其活化熵一般在230到240单位之间。
因此通过把两个反应底物结合到抗体的活性部位,应当能极大地加速D iels2A lder反应的速度。
H ilvert用16作为半抗原产生的抗体催化N2乙基马来酰亚胺与四氯噻吩二氧化物加成,因为反应中有二氧化硫放出,产物阻化作用应很小。
确实,分离出的抗体促进了D iels2A lder反应,其有效浓度至少达110M 结合位置,转化数K cat=50。
催化D iels2A lder反应的成功有非常重大的意义,因为自然界中不存在催化D iels2A lder反应的酶,这是人类智慧与技巧胜过自然界的例证,见图7。
41116 催化环氧的开环反应[13]空间电子约束,17中的环氧开环反应一般有利于生成四氢呋喃衍生物18,但Scri pp s研究人员用19为半抗原,激发一种专一免疫反应,产生的抗体酶催化17产生了新的开环方式,生成四羟基吡喃产物20,见图8。
天然酶只能加速反应速度,而不能改变反应产物,抗体酶则不然,正如Janda[14]所说:抗体酶可以创造新的化学反应。
有人甚至说,抗体酶的进一步发展,有可能改变整个化学工业的格局[15]。
图841117 催化酰胺键和肽键的水解[16]肽键水解是有一定能量要求的反应。
L erner和Schu lts曾认为催化这样的反应是他们的长期战略目标,然而这项工作已经取得突破性进展。
L erner小组用固相合成法合成了半抗原21,将其联接到载体蛋白上,免疫动物后产生的抗体在金属离子Co3+存在下,这些抗体能专一性催化水解22中甘氨酸与丙氨酸之间的肽腱,未来的挑战将是发展能选择性催化水解我们感兴趣的其它肽和蛋白质序列。
41118 其它应用[5]抗体酶在化学领域还有很多用途。