高中生物选修1生物技术实践学案 实验2 分离以尿素为氮源的微生物
实验2分离以尿素为氮源的微生物
二、实验内容
（三）设备及用品：略 （四）材料
1、100mL烧杯：装有50mL70%酒精，浸泡着玻璃刮刀
2、全营养LB固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、NaCl、 琼脂糖、水。 3、尿素固体培养基：葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、 琼脂糖、水、尿素。 4、5支有塞试管：盛有4.5mL蒸馏水 5、250mL三角瓶：盛有90mL蒸馏水
不一定，有些细菌能利用其它微生物的代谢产物。
思考与练习：
本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实 质上一样吗？ 实验名称
大肠杆菌 培养和分离 分离以尿素 为氮源的微 生物
分离方法
划线 分离法 涂布 分离法
分离内容
从同种菌种中分 离得到同种菌的 单菌落 从土壤浸出液里 所存在的各种细 菌中将含有脲酶 的细菌分离出来
这说明能利用尿素的细 菌在土壤菌群中只占少数。 因为人和其他哺乳动物产生 的排泄物毕竟是少量的，且 尿素还可以在高温下自然分 解，因此，以尿素为氮源的 菌群较少。
2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用 • 土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨 使土壤碱化，氨还与SO42-等离子形成化合物， 使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体 降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界 中氮的循环。
6、土样：从有哺乳动物排泄物的地方取（粪便中含尿素， 利于含脲酶的微生物生长）
配制培养基
实验组 选择培养基 • 尿素培养基 葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 琼脂糖 0.5g 酚红 0.25g 尿素 10ml 对照组
• LB培养基 蛋白胨： 0.25g 酵母提取液： 0.12g NaCl： 0.25g 琼脂糖： 0.5g
实验2
《分离以尿素为氮源的微生物》 讲义
《分离以尿素为氮源的微生物》讲义一、实验目的了解以尿素为氮源的微生物的特点，掌握分离此类微生物的方法和原理，培养微生物实验操作的基本技能。
二、实验原理在自然界中，能够分解尿素的微生物相对较少。
尿素在脲酶的作用下分解产生氨，使培养基的 pH 升高。
基于这一特性，我们可以通过在培养基中添加酚红指示剂来指示 pH 的变化。
当培养基中产生氨时，pH 升高，酚红指示剂会由黄色变为红色，从而筛选出能够分解尿素的微生物。
三、实验材料和用具1、培养基（1）制备尿素固体培养基：葡萄糖1g，NaCl 05g，KH₂PO₄01g，Na₂HPO₄ 02g，尿素 1g，琼脂 15g，水 100mL。
将上述物质溶解后，调节 pH 至 70，加入酚红指示剂 001g，灭菌备用。
（2）制备尿素液体培养基：除了不添加琼脂外，其余成分与尿素固体培养基相同。
2、实验用具无菌培养皿、无菌移液管、无菌涂布器、酒精灯、超净工作台等。
3、样品土壤、污水等。
四、实验步骤1、土壤样品的采集在有植被覆盖的土壤中，选择距离表层 5 10cm 处的土壤，用无菌小铲采集适量土壤，装入无菌袋中。
2、制备土壤稀释液（1）称取 1g 土壤样品，放入装有 99mL 无菌水的三角瓶中，振荡摇匀，制成 10²倍稀释液。
（2）以此类推，进行梯度稀释，制成 10³、10⁴、10⁵等倍数的稀释液。
3、接种（1）平板涂布法：用无菌移液管吸取 01mL 不同稀释度的土壤稀释液，分别涂布在尿素固体培养基表面，每个稀释度做三个重复。
（2）平板划线法：用接种环蘸取少量土壤稀释液，在尿素固体培养基表面进行划线，每个稀释度做三个重复。
4、培养将接种后的培养皿倒置放入 37℃恒温培养箱中培养 2 3 天。
5、观察与筛选观察培养皿中菌落的生长情况，挑选周围出现红色环带的菌落，即为分解尿素的微生物。
五、注意事项1、实验过程中要严格遵守无菌操作原则，防止杂菌污染。
2、土壤稀释液的梯度要合适，过高或过低的稀释度都可能影响实验结果。
高中生物-分离以尿素为氮源的微生物
高中生物-分离以尿素为氮源的微生物1.菌种特点含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
2.培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以3.实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。
(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨气3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。
4.实验步骤5.反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解并产生碱性的氨，使培养基上菌(1)分离以尿素为氮源的微生物时，配制的培养基中加入酚红作为酸碱指示剂，加入琼脂作为凝固剂(❌)(2)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(错误)(3)从物理性状的角度看，选择培养基多属于固体培养基(正确)(4)对细菌进行计数只能采用涂布分离法，而不能用划线分离法(❌)精确——涂布(5)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(正确)(6)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(错误)如图为分离以尿素为氮源的微生物的实验，思考回答下列问题：(1)实验目的是使用含有尿素的培养基分离能产生脲酶的细菌，使用酚红指示剂作为指示剂。
(2)有脲酶的细菌菌落周围出现有色环带的原因是什么？细菌分泌脲酶，可以将尿素分解为氨气改变酸碱度，使酚红指示剂变红(3)制备尿素固体培养基的过程中采用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌法、G6玻璃砂漏斗过滤法。
(4)从上图所示实验过程中可判断出细菌悬液C的稀释度为10^-4 。
1.幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。
在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。
实验基本步骤如下：配制培养基→灭菌、倒平板→X→培养→观察请回答下列问题：(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有___脲酶_____，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现___红___色环带。
(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是______D____灭菌。
实验2分离以尿素为氮源的微生物
稀释度10-3
稀释度10-4
LB固体培 养基
氮 源
实施方案
3、用涂布分离法分离细菌
10-3、10-4、10-5、 10-6各做三个培养皿
的
4、将培养皿倒置培养。
微
37 ℃恒温培养24-48h
生
5、观察。
物
1、说出涂布分离时的注意事项？
分
离
六 2、与LB全营养培养基菌落数相比，尿素培养基上为
以
什么只有少量菌落？
尿
能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。
离
四 2、要分离以尿素为氮源的微生物，培养基如何选择？
以
如何设计对照实验？设计实验还要遵循什么原则？
尿
实验组：尿素固体培养基
素
对照组：全营养LB固体培养基
为 氮
设计方案
重复性原则。 3、尿素如何灭菌？为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固
源
体培养基？酚红的作用？
的
G6玻璃漏斗过滤； 琼脂未被纯化，有含氮化合物。
微 生
作为指示剂，NH3使培养基的pH升高，遇酚红呈红色； 4、本实验中用什么方法分离细菌？
物基
全营养LB固体培养基 尿素固体培养基
离 以
五
灭菌 (G6玻璃砂漏斗过滤尿素)
尿
倒平板 LB固体培养基和尿素固体培养基分别倒平板
素 为
2、制备细菌悬液 注意：取样时，尽量只取悬液。
浙科版高中生物选修一 《生物技术实践》
衢州二中 范苗
分
离
一
尿素（脲）是蛋白质降解的产物。人和其他哺
以
乳动物的尿中都含有尿素，但它不能直接被农作物
尿
吸收，大量的尿素存在会对会对环境造成污染。
2024_2025学年高中生物第1部分微生物的利用第2课时分离以尿素为氮源的微生物学案浙科版选修1
第2课时 分别以尿素为氮源的微生物[学习目标] 1.进行微生物分别。
运用含有尿素的培育基，采纳涂布分别法，分别有脲酶的细菌。
2.运用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。
3.说明分别以尿素为氮源的细菌的试验原理。
4.举例说明本试验分别出来的细菌不肯定都是以尿素为氮源的细菌。
一、试验原理1.脲和脲酶(1)脲：又称尿素，是蛋白质降解的产物。
人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。
(2)脲酶：降解尿素的酶。
(3)以尿素为氮源的微生物的特点：含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。
其利用尿素的反应式为：(NH 2)2C==O ＋H 2O ――→脲酶2NH 3＋CO 2。
2.试验目的(1)运用专一的培育基(含有尿素)分别专一的细菌(有脲酶的细菌)。
(2)利用指示剂颜色的变更检知酶(脲酶)所催化的反应。
3.试验原理(1)不同微生物利用的氮源种类不同，有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。
(2)尿素在脲酶的作用下降解产生NH 3，使培育基的pH 上升，培育基中的酚红指示剂变成红色。
4.两种培育基的比较 项目全养分LB 固体培育基 尿素固体培育基 培育基组成 0.25g 蛋白胨，0.12g 酵母提取物，0.25gNaCl ，0.5g 琼脂糖，25mL 水 0.025g 葡萄糖，0.12gNaCl ，0.12gK 2HPO 4，0.25mg 酚红，0.5g 琼脂糖，15mL 水，10mL 尿素溶液灭菌 方法高压蒸汽灭菌 10mL 尿素溶液采纳G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，其余用高压蒸汽灭菌，60℃时两者混合 上述属于选择培育基的是尿素固体培育基。
用琼脂糖代替琼脂配制固体培育基的缘由是：琼脂中含有少量含氮化合物，用琼脂糖代替琼脂作为微生物培育基的固化剂，是为了尽可能使培育基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌利用，有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。
高一生物分离以尿素为氮源的微生物
实验步骤
• (1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液 体培养基分别装入两个250ml
• 的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。
• (2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个 培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。
• (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到 三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培 养12h。
实验材料：
(1)25mlLB固体培养基：蛋白胨0.25g、酵母提取物0.12g、NaCl 0.25g、琼脂0.5g、加水25ml。
(2) 25ml尿素固体培养基：0.025g葡萄糖、NaCl 0.12g、 K2HPO40.12g、酚红0.25mg、琼脂0.5g、加水15ml。灭菌冷却 到60℃时加入经G6玻璃漏斗过滤（使其无菌）的尿素。
• 实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。
再见
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
实验目的：
• 1. 使用专一的培养基（含尿素）分离专一 的细菌（有脲酶的细菌）。
• 2.使用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所 催化的反应。
实验原理：
脲即尿素，是蛋白质降解的产物。有 一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的 平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。
《分离以尿素为氮源的微生物》 讲义
《分离以尿素为氮源的微生物》讲义一、实验目的了解以尿素为氮源的微生物的特点，掌握分离这类微生物的方法和原理，培养实验操作能力和科学思维。
二、实验原理尿素是一种有机氮化合物，在土壤中，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源生长繁殖。
脲酶可以将尿素分解为氨和二氧化碳，氨会使培养基的 pH 升高，从而使酚红指示剂变红。
基于这个原理，我们可以通过在培养基中添加尿素和酚红指示剂，来筛选和分离出能够分解尿素的微生物。
三、实验材料和用具1、培养基尿素固体培养基：葡萄糖、NaCl、K₂HPO₄、琼脂、尿素（加热使其溶解）、酚红（在培养基灭菌并冷却到 60℃左右时加入）。
2、样品取自富含微生物的土壤或其他相关环境。
3、仪器和用具无菌培养皿、涂布器、移液管、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱等。
四、实验步骤1、制备培养基按照配方准确称取各成分，将除尿素和酚红之外的成分溶解在蒸馏水中，并调节 pH 至 70 左右。
加热使培养基融化，然后进行高压蒸汽灭菌。
待培养基冷却至 60℃左右时，加入经过过滤除菌的尿素和酚红溶液，摇匀后倒入无菌培养皿中，使其凝固形成平板。
2、采集样品从富含微生物的土壤中采集样品，放入无菌的容器中。
3、样品稀释将采集的样品放入装有 90mL 无菌水的三角瓶中，充分振荡，制成10⁻¹的土壤稀释液。
然后依次进行 10 倍梯度稀释，得到 10⁻²、10⁻³、10⁻⁴等稀释度的土壤稀释液。
4、涂布平板选择合适的稀释度（通常为 10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶），吸取 01mL 稀释液，滴加到尿素固体培养基平板上。
用涂布器将稀释液均匀地涂布在培养基表面。
5、培养将涂布好的平板倒置放入 37℃恒温培养箱中培养 24 48 小时。
6、观察和挑选培养结束后，观察平板上菌落的生长情况。
能分解尿素的微生物形成的菌落周围会出现红色的环，这是由于尿素被分解产生的氨使 pH 升高，酚红指示剂变红所致。
2018-2019学年浙科版选修1 第一部分 第2课时 分离以尿素为氮源的微生物 学案
第2课时 分离以尿素为氮源的微生物一、实验目的、原理1．实验目的(1)使用专一的培养基(含有尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。
(2)利用指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。
2．实验原理 (1)不同微生物利用的氮源种类不同，有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。
(2)尿素在脲酶的作用下降解产生NH 3，使培养基的pH 升高，于是培养基中的酚红指示剂变成红色。
思考 能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的细菌吗？答案 原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的过程。
有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长和繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需要进一步验证。
探究1——注重方法1. 酚红指示剂的选择本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色的pH 范围是6.4～8.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色。
以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的NH 3使培养基的pH 升高变成碱性，于是培养基中的酚红指示剂变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
2．培养基的配制与灭菌上述是选择培养基的是尿素固体培养基。
用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是：琼脂中含有少量含氮化合物，用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，是为了尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌利用，有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。
思维拓展 常见选择培养基的用途不同(1)加高浓度食盐：用于筛选获得金黄色葡萄球菌。
(2)加青霉素：用于筛选获得真菌(酵母菌和霉菌)，原理是青霉素能破坏原核生物的细胞壁，杀死原核生物。
(3)缺少氮源的培养基：用于筛选得到自生固氮菌。
(4)缺少碳源的培养基：筛选自养型微生物。
3．分离原理尿素固体培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源；缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能正常生长繁殖，所以，用尿素固体培养基能够筛选出分解尿素的微生物。
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实验2 分离以尿素为氮源的微生物
1．实验原理 脲或称尿素，是 降解产物，有一些细菌含脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。
在尿素固体培养基中加入 指示剂，如有含脲酶的细菌存在，这些细菌会向外分泌脲酶，使培养基中的尿素分解产生氨，导致培养基pH 升高，颜色变 。
可用______________固体培养基作为对照。
2．实验步骤
3．实验结果
4．讨论分析
·题组训练
1．下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是（ ）
A ．葡萄糖、NaCl 、K 2HPO 4、酚红、琼脂糖、水
B ．蛋白胨、酵母提取液、NaCl 、K 2HPO 4、酚红、琼脂糖、水
C ．葡萄糖、NaCl 、K 2HPO 4、酚红、琼脂糖、水、尿素
D ．蛋白胨、酵母提取液、NaCl 、K 2HPO 4、水、尿素
2．幽门螺杆菌（Hp ）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。
在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。
实验基本步骤如下：
(NH 2)2C=O+H 2O 脲酶 2NH 3+CO 2
请回答：
（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现色环带。
（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。
A．高压蒸汽 B．紫外灯照射 C．70％酒精浸泡 D．过滤
（3）步骤X表示。
在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。
菌液稀释的目的是为了获得菌落。
（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在中。
若不倒置培养，将导致。
（5）临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的_________分解为NH3和14CO2。
现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示：
3．
（1）欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布个平板，通常以每个培养皿中有个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
（2）接种后的培养皿于37 ℃的恒温箱中培养。
若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现，这是由于尿素被分解产生氨，遇培养基中的产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
（3）分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是。
（4）下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是（多选）（）
A．称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分 B．倒平板 C．涂布平板 D．微生物的培养
（5）与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因
是。
4．各种微生物对氧的需求是不同的，研究组开展了氧对微生物的影响实验，请回答下列问题：
(1)将含有LB固体培养基(刚配好，尚未凝固)的锥形瓶放入高压蒸汽灭菌锅，若在121 ℃条件下灭
菌，则灭菌时间一般为________min，灭菌时间从_________________开始。
灭完菌后将锥形瓶取出，待
温度下降到60 ℃(不烫手的温度)时，用______________擦拭桌面和双手，在超净工作台的___________ 旁将锥形瓶中的LB培养基分装到一系列试管中，并做标记。
(2)当试管温度下降到40 ℃(培养基还是液态)时，用灭菌过的移液器吸取0.1 mL的各类微生物悬液加
到相应试管中并封口，双手快速搓动试管，使菌种_______ ___于培养基内后迅速将封口的试管放置
在______ __条件下使培养基凝固。
(3)将上述试管放置于常温条件下培养
48小时后观察实验结果，下图中表示果酒
制作菌种的图是________。
实验2分离以尿素为氮源的微生物
1．蛋白质酚红红 LB全营养 2．99 玻璃刮刀 3．较多少量红
·题组训练
1．C
2．（1）脲酶红（2）D （3）接种涂布单（4）恒温培养箱无法形成单菌落（5）尿素3．（1）无菌水320（2）倒置红色环带酚红指示剂（3）以尿素作为唯一氮源（4）BC（5）土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
4．(1) 15 达到规定压力酒精棉酒精灯火焰 (2)均匀分布低温 (3) B。