电镜制样须知[1]
电子显微镜制样及制样设备使用安全规程
电子显微镜制样及制样设备使用安全规程一、通则1.操作前应经过相关培训或学习过操作规程和安全规程，如果长期未操作应重新学习操作规程和安全规程。
2.认真检查劳动保护用品是否适用，穿戴好劳动保护用品后方可上岗。
3.注意安全用电，不要用湿手触摸开关、插座等。
设备电源应有可靠的接地装置。
4.设备使用完毕及时关闭电源、水龙头、气阀，用抹布将设备擦拭干净。
5.盛有溶液的容器必须贴上标签，标明成分、配制人姓名、保存起止日期。
6.配置电解液、萃取液等应在通风橱里操作。
7.废弃的电解液、萃取液等要按规定排放，不能随意乱倒。
8.使用化学溶液要谨慎。
如不慎将化学溶液溅到身上立刻用大量水冲洗；如不慎进入眼睛里，首先到214房间（走廊北头）用专用水管冲洗，然后去医院。
9.酒精和丙酮是易燃易爆品，不能储存在通风橱里，应放在化学品仓库里。
二、扫描电镜样品制备1.清洗试样用过的酒精和丙酮要收集起来集中处理，不能随意乱倒。
2.清洗试样应在通风橱内操作，应当用镊子放、取试样。
试样清洗后立即吹干，保存在有盖的容器里拿到扫描电镜室，暂时不观察的试样要保存在干燥器里。
3.如果试样需要磨抛，请遵守金相制样及制样设备安全规程。
三、LDM-150D离子溅射镀膜机1.抽真空前确认主阀在“真空”位置、玻璃钟罩的橡皮圈密封好。
2.真空度达到要求后方可加电压。
3.溅射过程中注意随时调节调压旋钮使离子流保持稳定。
4.溅射完成后要冷却1分钟左右再取出试样，以防试样温度过高发生意外。
5.设备停止使用时，玻璃罩内应经常保持真空，以免吸附气体。
6.拧放气阀时应谨慎，过度旋转容易使针在小孔内断裂或卡死。
7.本机溅射电压较高，操作过程如需打开控制台盖板，电源开关不能置于“高压”位置，以防触电。
四、Electromet-4电解抛光仪2.抛光试样时操作环境应保持通风良好。
3.试样应用镊子放、取，或戴上防酸手套。
不要直接用手拿4.倒出电解液时要谨慎，抛光操作时也要谨慎，不要溅到身体上。
常规电镜测试须知
常规电镜测试须知1. 明确需要采用的仪器是：透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope ，TEM ） 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope ，SEM ）；2. 标本送检前，请在中心实验室网页进行所用仪器的送样预约，并在 仪器公告 或附件 里 下载 填写 送样送样申请单申请单申请单，，所列内容均为必填项目内容均为必填项目，，请勿请勿留留白；3. 送样申请单送样申请单以及以及以及标本标记标本标记标本标记使用的使用的 学生姓名 联系方式 必须必须与与 在线申请账号 一致；4. 标本送检前，请按照电镜测试要求取材、固定，做好样品标签（具体要求见下页）；标记用标记用标签纸标签纸标签纸以及扫描电镜标本用以及扫描电镜标本用以及扫描电镜标本用小玻璃瓶小玻璃瓶小玻璃瓶请请自备自备，，标签标签与要求与要求与要求不不符者恕不接收者恕不接收；；5. 电镜室提供按照大于标本20倍体积的25%电镜级戊二醛原液，请送样之前来电镜室领取（自备冰盒和1.5ml Ep 管），4°C 避光保存，使用前用PBS 按1:9稀释成浓度为2.5%的工作液；6. 确保在线注册的导师账号中费用充足，方可进行送样预约，若不足，请充值：（1） 校本部校本部 导师签字后直接在财务转账到中心实验室后，在生科楼1楼 中心实验室 温老师 或 严老师 处提交《记账凭证》入账到导师账号（2） 附属医院 在医院借支票（交学校财务）或转账后，操作同（1）（3） 校外 转账到学校财务处（网址/cwc/），到账后，在财务处开发票（带回单位报销）及《记账凭证》（交生命科学楼1楼 中心实验室 温老师 或 严老师 入账到导师账号）7. 开发票前到电镜室或生科楼1楼填写《缴费凭证》和《检测预收费清单》交给学校财务开发票。
透射电镜透射电镜————用于观察细胞内部结构有髓有髓神经纤维神经纤维神经纤维 肝糖原聚集肝糖原聚集培养培养细胞中的自噬体细胞中的自噬体细胞中的自噬体 海藻海藻海藻常规透射电镜送样须知1. 透射电镜标本置于1.5ml Ep 管；2. 因电镜制样用包埋板尺寸限制，请使用姓名姓名姓名汉字汉字汉字和阿拉伯数字编号和阿拉伯数字编号和阿拉伯数字编号标记标本，参照下图所示的“张三1”；图一 标本标注方法3. 标签不得覆盖Ep 管，用中性笔中性笔中性笔注明姓名姓名姓名及及样品编号样品编号；严禁使用铅笔、记号笔或其他油性笔标记以免被洗脱；请勿使用能被液体浸润的标签纸（虽用封口膜等包裹也无济于事，见下图第4管），以防制样时脱落、模糊标记缺失；如下图显示被液体浸润的标签纸和油性笔标记的后果；参见参见展板展板展板实物实物戊二醛戊二醛固定后换固定后换PBS 加常规透射电镜送样须知——培养细胞样品（重要重要：：超微形态反超微形态反映映的是的是标本接触固定液标本接触固定液标本接触固定液瞬间瞬间瞬间的状态的状态的状态，，故必须必须及时及时及时固定固定固定））1. 细胞数细胞数量量的要求的要求：： 悬浮培养的细胞需要计数106/ml 、贴壁细胞则需选用6孔板长到对数生长期（融合度达70~80%），取其中1孔，使用细胞刮刮下细胞（自噬、凋亡类实验推荐）或胰酶消化细胞收集，数量可达106/ml ；2. 细胞细胞收集收集收集及注意事项及注意事项及注意事项：吸掉含有血清的培养基，加入无血清培养基或PBS 1ml 刮下细胞，移入1.5ml 尖底Ep 管，离心5min （离心速度800-2000rpm 之间，请根据离心机型号自行决定；也可以参考培养细胞时的离心速度），使细胞形成约0.5-1mm高的细胞团块；见照片左侧“标准1”管所示所示；注意注意：：细胞团过大、或呈絮状，如照片“标准2”和“标准3”的细胞团较大，都会影响固定效果；参见参见展板展板展板实物实物3. 细胞细胞固定固定固定：：吸去无血清培养基，轻柔地沿管壁缓慢加入500µl 已提前恢复至室温的2.5% 戊二醛，切勿吹悬，避免震荡；室温1Hr ，再4°C 冰箱静置3Hr 后，吸出戊二醛，加满PBS 于4°C 冰箱静置，或送电镜室。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
透射电镜制样步骤以及注意事项
透射电镜制样步骤以及注意事项透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是目前最常用的高分辨率电子显微镜，可以用于观察物质的微观结构。
制备TEM样品的过程非常重要，下面将详细介绍TEM制样的步骤以及需要注意的事项。
制备TEM样品的步骤一般包括样品的选择、固定与固化、切片、薄化、网格制备和贴膜等。
第一步是样品的选择，样品应具有研究价值且适合观察。
例如，生物样品可以是细胞、组织或器官的薄片，金属样品可以是扁平的块状、粉末或薄膜等。
第二步是固定与固化。
对于生物样品，常用的固定方法包括浸泡法、灌注法和切片冷冻法；对于无机样品，可以使用固定剂将样品固定在固定剂中。
第三步是切片。
将固定好的样品切割成薄片，一般要求薄片的厚度在100 nm以下，通常使用超薄切片机来进行切割。
第四步是薄化。
将切割好的样品进行薄化处理，使其达到TEM观察所需的薄度。
常见的薄化方法有机械薄化、电化学薄化和离子薄化等。
第五步是网格制备。
将薄化好的样品放置在铜网格上，网格的选取应该根据所研究样品的性质和需要进行选择。
最后一步是贴膜。
将组织切片或带有样品的网格进行贴膜，以保护样品并提高图像的对比度。
在以上步骤中，需要注意的事项有：1.样品在制备过程中要避免受到污染或氧化，尽量在纯净无尘的环境中进行操作。
2.固定剂的选择要合理，不同的样品可能需要使用不同的固定剂，应根据需要进行选择。
3.切片时要注意刀片的尖锐度和切割角度，以免对样品造成损伤或变形。
4.薄化过程中要控制好加工参数，以保证样品的均匀薄化。
5.制作网格时应选择合适的网格尺寸和类型，以适应观察需求。
6.贴膜时要使薄膜均匀平整，并避免出现气泡或杂质。
总之，TEM制样是一项复杂而关键的过程，要保证样品的质量和可观察性，需要仔细选择方法、控制操作参数、注意样品的保护与处理。
合理的样品制备能够获得高质量的TEM图像，并提供准确的实验数据和结论。
组织电镜的制作
一、组织样品的取材应注意四点：
1）材料要新鲜，组织离体后应立即投入固定液中。
2）组织的大小要合适，部位要准确，预固定组织大小约为：2mm×5mm×10mm。
3）避免人为损伤。
4）较低温度下进行，保存样品的温度为，4℃。
二、细胞收集固定方法：（适用于培养细胞、液体培养细菌等）
1）取培养细胞2~4ml，放于离心管中，用1500~2000转/分离心10-15分钟，弃去上清液；
2）吸管沿管壁缓慢加入约0.5%戊二醛固定液（原液用PBS 1:6稀释），在4°C环境中静置15-30分钟；
3）再用10000-13000转/分离心10-15分钟，弃去上清液；
4）用吸管沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液即可。
注意：1. 收集后如不能及时送样，可保存在4°C环境中。
2. 高速离心离紧后的样品为体积不小于2mm×2mm×2mm（约半颗绿豆大小）的固体样。
三、电镜超薄切片制样过程：
样品经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，日立H-600IV型透射电镜观察。
* 特殊组织样品（如眼组织、脑组织、骨组织等）的取材请详细咨询*
四、常用固定液的配制
1）磷酸盐缓冲液配制的戊二醛固定液：
2）二甲胂酸钠缓冲液配制的戊二醛固定液：
3）2%多聚甲醛—2.5%戊二醛固定液：。
透射电镜制样要求与制样方法
透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。
2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。
3. 样品在高真空中能保持稳定。
4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。
TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。
用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。
载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。
但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。
碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。
从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。
微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。
观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。
超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。
这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。
主要针对粒度较小的纳米材料。
如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。
所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。
纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。
电镜样品制作(完全版)
相关仪器的信息：透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。
二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。
固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。
五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。
电镜测试标本送样须知
常规电镜测试须知1.请在实验前一周内到电镜室取样品固定所需固定液2. 2.5%戊二醛4℃避光保存，2周内有效3. 2.5%戊二醛固定后标本4℃保存2月内有效4.*戊二醛请避免超时使用5.请按照要求取材、固定，做好样品标签6.送样品时须按照200元人民币/例样品缴齐押金，样品测试结束、交齐测试费后，退回押金；1)每例透射样品只随机切一张含有若干标本切片的200目铜网，如需要增加切片数量，按100元/张切片、染色。
2)扫描电镜如仅需要喷镀，则制样费按100元/例收取3)透射样品如在制样周期外要求制样，可选择自行处理或250元/例加急处理4)取材不符合要求，电镜室拒收；如因取材、固定问题导致无满意结果，请自行负责。
5)！！超出预约时间30min未到电镜室，按照100元/小时收取费用。
6)！！固定液：透射电镜工作液500μl/例，超出按10元/ml收费。
7)！！每学期寒暑假前1个月停止制样。
8)有疑问请联系工作人员电话：62789057，内线：89057收费标准1指在电镜下观察标本、拍照2CCD数码照片3透射电镜制样的全套！指由已固定样品到观察前所有步骤4指由已固定样品到树脂块5指a提供树脂块切片，b要求切片数量超出一张范围时a指在电镜下观察标本、拍照c扫描电镜制样的全套指由已固定样品到观察前所有步骤d指由已固定样品到干燥e指干燥的不需处理样品单纯喷镀*校外人员开具税务发票，需另加6%的税点。
测试结束后，带电镜室缴款通知到学校办公楼一楼财务室缴费，自带记账凭证或税务发票到电镜室，退回押金。
扫描电镜用于表面观察，结果图示扫描电镜1生物材料表面生长细胞扫描电镜2肾小球结构透射电镜用于观察细胞内部结构，结果图示透射电镜 1肝糖原聚集透射电镜 2 培养细胞常规透射电镜送样须知-培养细胞请按要求取材1)细胞数：106或25ml培养瓶达到生长面积的80%，贴壁细胞使用细胞刮刮下细胞或消化液消化细胞；2)使用4℃的PBS(0.2M pH7.4)或生理盐水对细胞进行离心漂洗2-3次。
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TEM样品：
1、样品制备需在自己实验室完成，电镜室不提供制样设备。
2、样品制完如需放置几天再来测试的，建议保存在干燥器或真空干燥箱中。
3、为了加快测试效率，预约了上午测试的，请提前一天将样品送到电镜室；预约了下午测
试的，请在当天上午下班前将样品送到电镜室。
原因是放样品需用提前抽真空，一般是10-30分钟，根据样品的具体情况而定。
SEM样品：
1、从2015年3月1日开始，样品制备需在自己实验室完成，电镜室不提供制样设备，只
负责喷金处理。
2、如需导电胶、样品台等制样耗材，请自行购买。
如需协助，请来电镜室咨询。
3、样品制完如需放置几天再来测试的，建议保存在干燥器或真空干燥箱中。