扫描电镜样品制备讲解
扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy）是一种高分辨率的电子显微镜技术，可用于观察和分析各种材料的表面形貌和微观结构。
为了获得清晰的显微图像，样品制备和操作步骤非常重要。
一、样品制备1. 样品的选择：场发射扫描电镜适用于不同种类的材料，如金属、陶瓷、聚合物等。
选择合适的样品很关键，它应具备研究对象的特性，并且能够承受电子束的辐照。
2. 样品的固定：为了保持样品的形状和结构不变，通常需要将其进行固定。
对于固态材料，可以使用金属夹片或导电胶进行固定。
对于液态材料，可以将其冷冻或凝胶化，以保持其形状。
3. 样品的切割和打磨：有时候，需要将样品切割成适当的尺寸，以便放入样品架中。
这可以通过使用金刚石切割机、电解或机械研磨仪器等设备来完成。
4. 样品的真空处理：在将样品放入场发射扫描电镜前，通常需要将其进行真空处理。
这可以通过将样品放入真空干燥器中、在低压下进行加热或冷冻干燥来完成。
真空处理有助于去除空气中的水分和气体，以减小背景干扰。
二、操作步骤1. 打开电镜系统：在开始操作前，需要将场发射扫描电镜系统打开并进行预热。
预热时间通常需要几十分钟，以保证系统内部达到稳定的工作温度。
2. 放置样品：将样品放置在样品架上，并确保其良好接触。
对于粉末状样品，可以使用导电胶将其固定在样品支架上。
对于固态样品，可以使用金属夹片固定在样品架上。
3. 调整显微镜参数：通过调整电子束能量、聚焦、工作距离等参数，来优化扫描电子显微镜的成像质量。
这些参数的选择取决于样品的特性和所需的分辨率。
4. 开始观察：一切准备就绪后，可以开始观察样品。
通过控制电子束的扫描和探测系统，可以获得样品的表面形貌和微观结构的信息。
在观察过程中，要注意避免样品表面的污染和损坏。
5. 数据分析：场发射扫描电镜获得的图像可以进一步进行数据分析。
可以通过对图像进行增强、测量尺寸和形状、进行结构分析等手段，来得到更详细的样品信息。
基础实验——扫描电镜样品制备！
基础实验——扫描电镜样品制备！扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。
扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。
关于生物样品的制备，中洪医学实验君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！1样本要求扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。
但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。
1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。
3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。
4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。
对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
2化学方法制备样品化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。
1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。
亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。
2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。
四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。
这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。
扫描电镜样品制备
防止污染和氧化
保持清洁
在制样过程中，要保持样品和工具的清洁，避免引入污染物。
真空保存
将制备好的样品存放在真空环境中，以防止氧化和污染。
使用惰性气体
在需要的情况下，可以使用惰性气体（如氮气或氩气）来保护样 品，避免其与空气中的氧气或水分发生反应。
控制温度和湿度
恒温环境
在制样过程中，要保持恒定的温度，避免温度波 动对样品造成影响。
处理
对于某些难以清洁的样品，可以采用 适当的化学或物理方法进行处理，如 超声清洗、离子溅射等。处理后的样 品应保持干燥，避免受潮或污染。
02
扫描电镜制样方法
机械切割法
锯切
抛光
适用于较厚样品的初步切割，使用金 刚石锯片，注意控制切割速度和冷却 液的使用。
提高样品表面光洁度，常用抛光布和 抛光液，注意抛光时间和抛光液的选 择。
稳定性
样品在电子束轰击下应保持稳定， 不产生明显的形变或化学反应。
样品尺寸与形状
尺寸
通常要求样品尺寸在扫描电镜的 样品台范围内，一般直径不超过 30mm，厚度不超过5mm。
形状
样品形状应尽量规则，避免存在 尖锐边角或突出部分，以便于放 置在样品台上并保证成像质量。
样品表面清洁处理
清洁
样品表面应清洁无污物，避免尘埃、 油脂等杂质影响成像质量。
磨削
用于进一步减小样品尺寸和去除表面 粗糙度，可使用砂纸、砂轮等磨具， 注意选择合适的磨料粒度和冷却液。
化学腐蚀法
酸蚀
利用酸溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面氧化物和污染物，注意 选择合适的酸溶液浓度和腐蚀时
间。
碱蚀
利用碱溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面油脂和有机物，注意碱
扫描电镜样品制备及图像质量影响因素分析①
扫描电镜样品制备及图像质量影响因素分析①扫描电镜（SEM）是一种常用的表面形貌分析仪器，广泛应用于材料科学、生物学、医学、环境科学等领域。
在使用SEM进行样品观察时，样品的制备和图像质量是影响观察结果的重要因素。
本文将对扫描电镜样品制备及图像质量的影响因素进行分析，以帮助读者更好地理解SEM样品制备的重要性及其影响因素。
一、扫描电镜样品制备1. 样品的选择在进行SEM观察之前，需要选择合适的样品。
对于金属、陶瓷等导电性较好的材料，直接使用即可；对于生物组织、有机材料等非导电性较弱的样品，需要进行金属涂覆或其他处理使其导电后才能进行观察。
样品的形貌、尺寸等也需要根据实际观察要求进行选择。
2. 样品的固定和处理在进行样品制备时，需要对样品进行固定和处理，以保证其在观察过程中不发生形变或损坏。
对于生物组织等脆弱的样品，可以采用冷冻切片、化学固定等方法进行处理，以保持其原始形态和结构；对于金属、陶瓷等硬质样品，可以采用机械切割、抛光等方法进行处理。
3. 样品的真空干燥在进行观察之前，需要将样品进行真空干燥，以保证在真空环境下观察时不会产生气泡或水汽等影响观察效果的情况。
真空干燥可以采用常规真空干燥箱、真空冷冻干燥机等仪器进行处理。
4. 样品的金属涂覆对于非导电性材料，需要进行金属涂覆处理，以提高其导电性。
常用的金属涂覆材料包括金、铂、铬等，可以通过喷镀、溅射等方法进行涂覆。
涂覆后的样品表面会形成一层导电薄膜，有利于SEM图像的质量和清晰度。
二、图像质量影响因素分析1. 样品表面形态样品的表面形态是影响SEM图像质量的重要因素之一。
在进行观察之前，需要对样品进行良好的抛光处理，以保证其表面光滑、无明显划痕或颗粒。
表面形态不良会导致图像中出现扭曲、模糊等情况，影响观察结果的准确性。
2. 样品的导电性样品的导电性对SEM图像质量也有重要影响。
非导电性材料在观察时容易产生电荷积聚和电子束散射，导致图像中出现椭圆失真、光晕等现象，降低图像的分辨率和清晰度。
电镜样品的制备最新课件
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗 ➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接 近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
固定 ➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
第一节 扫描电镜样品的常规制备技术
菌类和组培细胞
粘样或滴样
熏蒸固定
干燥
取清 材洗
冷冻
断裂
固 清洗 脱 定水
干 粘镀镜 燥 样膜检
管道铸型
花粉、种子及孢子类样品
电镜样品的制备最新
腔形器 官
取材 一、取材 即：获取观察材料。
遵循五字原则：准、轻、小、净、浓
清洗
1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
固定
取材 三、固定方法
清洗 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
固定
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽 熏蒸固定0.5~1小时。
脱水 3.双固定： 戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
干燥 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
粘样 5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
霉菌 切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌电10镜μ样m品的制备最酵新母菌5 μm
曲霉20 μm
电镜样品的制备最新
第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
内部结构剖出法
切断法：多孔组织 简易剖出法 掰开法：实质性组织
拉断法：纤维组织
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。
然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。
下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。
1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。
该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。
该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。
2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。
这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。
它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。
3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。
这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。
4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。
该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。
总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。
每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
临界点干燥操作时的注意事项： ? 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 ? 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
主要优点： 景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物 样品的各种形貌特征。
二、实验用品
1. 材料 植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
2. 试剂 丙酮、乙醇、 2％戊二醛溶液、 1％锇酸、
0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液 体二氧化碳、导电胶等。 3. 器材
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、青 霉素小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉等。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
7. 粘贴样品
用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品 底面。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶 上。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和SEM镜 检。
8. 样品的导电处理
生物样品和其他非金属样品的表面电阻率很高，在电 镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是 由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的 发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此， 为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电 的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面导电处理。扫描 电镀样品的表面导电处理方法，主要有金属镀膜法和组织 导电处理法两种。其中金属镀膜法又有真空镀膜及离子溅 射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀膜法进行镀膜。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇 1：1的混合 液，浸泡 10-20 分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡 10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
? 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
? 加温置换：将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由 于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也 随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧 化碳充分置换。
? 气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随 着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳 的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经 5min后，即可排气。
离子溅射镀膜法 :
送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品 仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干 燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。 ? 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样 品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而 达不到临界点。 ? 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临 界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容 积的2/3左右。 ? 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到 充分的临界状态。 ? 开 、 闭 阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对 样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下 应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般 放气时间应在．4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中 午。
三、扫描电镜样品的制备
●
1. 取样： 将取下的动植物组织放入预冷的含有 2％戊二醛
溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长 4mm左 右、高 3mm 左右的小块。 2. 样品的清洁：
把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个 拨入盛有0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液的青霉素小 瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般 漂洗 1小时，换液 3-4次。
3. 样品的固定
样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和 方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描 电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品 表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也 与透射电镜样品处理有不同之处。
一般在4℃的条件下完成固定比较好， 戊二 醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛 -锇酸” 双重固定法。
? 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
? 注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的 进气阀在0～10℃下，向样品杯注入液体二氧化碳。
固定1-3小时（依样品种类和固定剂而已）后， 吸出固定液， 加入0.1mol/L PH7.2 磷酸缓冲液， 漂洗1小时，换液 3-4次。
4. 脱水
从小瓶中吸出缓冲液， 加入乙醇逐级梯度脱水， 脱水剂的乙醇浓度依次为 30%－50%－70%－ 80%－90%－100%乙醇（两次）逐级脱水；样品 在每级停留 15-30分钟。
? 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50％(通过刻度尺观察， 以液面超过样品笼为度)时，关闭仪器进气阀，静置15～ 20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后， 打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液 10min左右，(让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新 鲜的液态二氧化碳)再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳 至样品杯的80％左右，关闭进液阀，停止充液。