电镜切片样品制作步骤知识讲解
透射电镜生物样本制备流程及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。
它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。
然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。
下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。
一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。
常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。
2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。
通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。
3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。
二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。
超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。
2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。
离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。
三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。
2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。
通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。
这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。
3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。
树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。
四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。
透射电镜细胞样品制备流程
透射电镜细胞样品制备流程透射电镜细胞样品制备流程概述透射电镜（TEM）是一种常用于观察细胞结构和超微结构的高分辨率显微镜。
样品制备是进行TEM观察的关键步骤，正确的制备流程能够保证样品的质量和结构完整性。
流程步骤1.选择适合的细胞样品–根据研究目的选择不同类型的细胞样品，如培养细胞、动物细胞组织或植物细胞等。
–样品选择要考虑细胞生长状态、形态和结构的要求。
2.采集样品–从培养皿中取出细胞，或从动物或植物组织中切取适当大小的样品。
–注意避免样品受到污染或损坏。
3.固定样品–使用适当的固定剂，如戊二醛、冰醋酸或凝胶固定剂，对样品进行固定处理。
–固定剂的选择要根据样品类型和所需观察结构的特点。
4.去除固定剂–使用缓冲液或盐水洗涤样品，去除多余的固定剂。
–洗涤时间和次数需根据固定剂的种类和浓度进行调整。
5.后续处理–为了进一步增强对样品的对比度和分辨率，可以对样品进行染色处理。
–常用的染色剂包括重质金属盐、乙酸铀和铅染色剂等。
6.样品包埋–涂覆样品表面的浸渍剂，如环氧树脂或丙烯酸树脂。
–用于支撑样品的网格可以放置在浸渍剂中。
7.制备超薄切片–使用超薄切片机将包埋的样品切割成透明的超薄切片。
–切片的厚度通常控制在70-100纳米之间。
8.将切片转移到网格上–使用特殊工具将切片转移到电子显微镜用的网格上。
–要小心操作，避免切片受到损坏或污染。
9.干燥和稳定–将转移到网格上的切片进行脱水和干燥处理，以提高稳定性。
–常见的方法包括用醇溶液进行脱水，然后使用气体吹干。
10.开始透射电镜观察–将处理完的样品装入透射电镜，调整参数和放大倍数。
–进行细胞结构和超微结构的观察和拍摄。
结论透射电镜细胞样品制备是进行TEM观察的关键步骤。
通过选择合适的细胞样品、适当的固定、去固定剂和染色处理，以及正确的样品包埋和超薄切片制备，可以确保样品的质量和结构完整性。
准确无误的制备流程能够为细胞学研究提供可靠的数据支持。
注意事项1.样品的选择要根据研究目的和所需观察结构的特点进行。
电镜制片
一．取材： 组织块小于1立方毫米 二．固定： 2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或 更长时间。 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次 1%锇酸固定液固定 2-3小时 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次
三．脱水： 50%乙醇 15-20分 70%乙醇 15-20分 90%乙醇 15-20分 90%乙醇 90%丙酮（1：1） 15-20分 90%丙酮 15-20分 以上在4度冰箱内进行 100%丙酮 室温 15-20分三 纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时 纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜 纯包埋液 37度 2-3小时 五．固化： 37度烘箱内 过夜 45度烘箱内 12小时 60度烘箱内 24小时 六．超薄切片机切片 50-60 nm 七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色 八．透射电镜观察。拍片
包埋剂
环氧树脂(Epon)包埋剂: Epikote812 (Epon 812) 162ml DDSA(十二烷基琥珀酸酐)100ml(软化剂) MNA(甲基丙次甲基邻苯二甲酸 酐)89ml(硬化剂) DMP ～30(2,4,6,二甲氨基甲基苯酚) 3～ 4滴 60℃条件下,聚合48小时.
制刀机
半薄切片机
超薄切片机
透射电镜
电镜样品制作(完全版)
相关仪器的信息：透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。
二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。
固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。
五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。
电镜切片样品制作步骤
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------电镜切片样品制作步骤扫描电镜样品的准备 A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；细胞使用 PBS 或无血清培养基离心漂洗 1~2 次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在 5min 内；细胞团根据预设浓度在适量 2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降 2~3 天，在托盘周围加入 PBS，以防止样品干燥。
B 贴壁培养的细胞：在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS 或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定 1h，4℃ 3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满 PBS 送检。
SEM 标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。
C 组织取材样品观察表面可达 8~10mm 2 ,高度小于 5mm 左右；样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或 PBS 冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。
能够明确标识标本的观察面。
消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。
如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器1/ 4是否需要灌注清洗；固定 2.5%戊二醛浸没标本，室温 1h，4℃固定 3h 以上，换 PBS 送检。
附：2.5% 戊二醛的配制 Step 1: 0.2M 磷酸缓冲液的配制：--------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6 克磷酸氢二钠 (Na2HPO4.12H2O) 29 克双蒸馏水加至500 毫升 pH 调至 7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制：--------------------- 25% 戊二醛 1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L 磷酸缓冲液 5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH 值 7.3-7.4 透射电镜样品的制备一、培养细胞本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。
电镜样品处理流程
电镜样品处理流程电镜样品处理流程可以分为以下几个步骤：1. 采集样品：根据需要，选择合适的样品进行采集。
样品可以是细胞、组织、材料等。
2. 传统固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构的稳定性。
常用的固定剂有冰乙酸、乙醛、戊二醛等。
3. 脱水：将固定后的样品通过浓度递增的酒精溶液进行脱水处理，以去除组织中的水分。
常用的脱水溶液有30%，50%，70%，95%，100%的酒精。
4. 渗透：将脱水后的样品通过有机溶剂（如丙烯酸甲酯，或Epon等）进行渗透，使其逐渐转变为切片时易于切割和观察的坚硬物质。
5. 嵌包：将渗透后的样品置于嵌包物（如丙烯酮），并放入模具中固定，以形成坚硬的嵌包样品块。
6. 切片：将嵌包样品块进行切片处理，常用的切片工具有超薄切片机。
7. 上网：将切片后的样品片置于网状金属网底上，并使用适当的胶水或聚合物将其固定在网上。
8. 吐壳：将样品上的嵌包剂和其他杂质去除，使样品表面清晰可见。
可以使用酶解等方法。
9. 染色：根据需要，对样品进行染色处理，以增加对比度和观察效果。
常用的染色剂有重金属盐、酸性着色剂等。
10. 干燥：将染色后的样品片在通风处晾干，以去除残留的溶剂和水分。
11. 金属蒸镀：将样品片放置于金属蒸镀设备中，进行金属蒸镀处理，以增加样品的导电性，以便观察。
12. 观察和拍摄：将样品片放置在电子显微镜中，利用电子束对样品进行观察，可以通过摄像机等设备进行图像记录。
13. 分析和解释：根据观察到的图像和结构，进行分析和解释，得出相关结论。
14. 保存和归档：将样品片进行妥善保管，以备将来的研究和参考之用。
细胞电镜步骤
细胞电镜步骤一、引言细胞电镜（electron microscopy）是一种利用电子束代替光束进行显微观察的技术。
相比传统的光学显微镜，细胞电镜具有更高的分辨率和放大倍率，能够观察到更细微的细胞结构，为细胞学研究提供了重要的工具。
本文将介绍细胞电镜的主要步骤。
二、样品制备1. 固定要观察细胞的内部结构，首先需要将细胞固定在样品上。
常用的固定剂包括戊二醛、冰醋酸、乙醛等。
固定剂可以杀死细胞并保持其形态和结构。
2. 切片将固定的细胞组织进行切片，常用的切片工具有超薄切片机、刮刀等。
切片的厚度通常在50-100纳米之间。
3. 上膜将切片转移到铜或金网膜上，以便在电镜中观察。
上膜时需要小心操作，避免切片的损坏。
三、脱水和浸渍1. 脱水为了观察细胞的内部结构，需要将样品中的水分逐渐去除。
通常会使用一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理。
2. 浸渍脱水后，为了使样品能够在电镜中导电，并增加样品的稳定性，需要进行浸渍处理。
常用的浸渍剂有丙酮、环氧树脂等。
四、显微观察1. 扫描电镜（SEM）扫描电镜主要用于观察样品表面的形态结构。
在扫描电镜中，电子束通过扫描样品表面，与样品反射的二次电子或反射电子相互作用，形成图像。
通过调整电子束的扫描方式和参数，可以获得不同放大倍率和清晰度的图像。
2. 透射电镜（TEM）透射电镜主要用于观察样品的内部结构。
在透射电镜中，电子束穿过样品，与样品内部的结构相互作用，形成投影图像。
通过调整电子束的聚焦和对比度，可以获得高分辨率的细胞内部结构图像。
五、图像处理和分析1. 图像获取使用电镜观察样品后，需要将观察到的图像记录下来。
可以使用相机或数字图像采集系统将图像转换为数字信号，保存在计算机中。
2. 图像处理对于采集到的图像，可以使用图像处理软件进行处理和增强。
常见的处理方法包括去噪、增加对比度、调整亮度等。
3. 图像分析通过对处理后的图像进行分析，可以获取细胞内部结构的定量信息。
常见的分析方法包括测量细胞器的大小、计算细胞器的分布密度等。
电镜样本制备原理
电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。
这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。
2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。
脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。
3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。
包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。
4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。
切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。
5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。
这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。
6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。
在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。
总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。
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A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；
细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。
B贴壁培养的细胞：
在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。
SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。
C组织取材
样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右；
样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。
能够明确标识标本的观察面。
消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。
如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；
固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。
附：2.5%戊二醛的配制
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4
一、培养细胞
✧本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。
1.细胞数量：106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。
2.离心收集：消化或用细胞刮刮下细胞。
如细胞状态一般或漂浮物较多，建议更换新培养
基；如观察自噬，建议刮下细胞。
3.离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义，时间在5min内；
4.细胞团大小：细胞最厚处约0.5~1.5mm,或者参照1元硬币的厚度；
5.细胞离心成团后去除上清，加2.5%电镜用戊二醛500μl固定，切勿吹悬，室温1h，4℃
3 h后，去除戊二醛加满PBS后4℃放置或送检。
✧注意：固定细胞不需要吹悬，细胞不宜过多，过多会导致固定液无法迅速渗透到底部细
胞；
二、生物组织
迅速剪下/切下相应位置，在2.5%戊二醛中，依据不同组织和实验目的，用刀片修成1mm3的小块或__mm2×2mm长条或薄片状。
在2.5%戊二醛室温1h，4℃3 h，去除戊二醛加满PBS，4℃放置或送检。
标本固定时，尽量修饰成合适的形状，对于需要定位的标本，离开实验室者后比较难以确认所需要的位置。
使用2ml圆底或尖底的EP管，勿用500μl以下的EP管。
✧
✧块状标本基本包含的组织类型：脑、肾、肝、肺、心肌；
✧
✧长条状、薄片状标本基本包括：
骨骼肌、平滑肌：肌纤维方向与标本长轴平行或垂直（送样时说明方向）
皮肤、毛囊：皮肤角质层与长轴平行；
神经、直径在2mm内的小血管：其长轴与标本块长轴平行的长条
消化道、大血管：长条片状，一侧是上皮、内皮细胞面，或依据目的去除无用的分层脑皮质、海马、耳蜗等：具有方向性或需横切或纵切面或需要组织中某一特定位置的标本；
具体到某些组织，可能会有不同的要求，如观察海马CA1区，建议标本取片状或近似三角形的片状或梯形（比较好）。
直观的说，小块直径约为1元硬币厚度；长度的短轴约为1元硬币的厚度；具体大小根据标本会有相应的调整，但都已小尺寸为佳。