电子显微镜生物样品的制备实验
电子显微镜中的样品制备技术
电子显微镜中的样品制备技术电子显微镜已成为现代材料科学、生物医学和纳米技术等领域的重要工具。
在电子显微镜中，样品制备技术是获得高质量显微图像的前提和基础。
本文将介绍电子显微镜中常见的样品制备方法及其优缺点，以及发展趋势和未来展望。
一、常规样品制备方法1. 切割法切割法是常见的制备厚度为几十微米到数百纳米的样品。
它采用超薄切片机或离心切片机，将待观察的样品切成薄片。
切割时需要使用钻头或刀片，因此会对样品产生一定的物理损伤。
优点：制备快速，薄片厚度可控。
缺点：易产生物理损伤，较难对液态、柔软、脆性或粘性样品进行切割。
2. 磨削法磨削法是制备几微米到数十纳米厚度的样品。
它使用极细的研磨粒子，将样品表面磨削平整。
这种方法适用于金属、半导体和陶瓷等硬质材料，但对于柔软或易变形的物质效果不佳。
优点：适用于硬质材料，制备速度较快。
缺点：对柔软或易变形的物质效果不佳。
3. 薄膜法薄膜法是制备数十纳米以下的厚度，常见于电子器件等领域。
它使用蒸镀、溅射或离子束沉积等方法，在基底上制备所需厚度的薄膜。
这种方法制备出的薄膜平整度高、精度好。
优点：适用于制备薄膜结构，制备速度较快。
缺点：需要设备的辅助支持，且对于大型体积的样品需要进行打薄等后续制备。
二、先进样品制备方法电子显微镜对于颗粒物、生物样品、纳米材料等领域的要求越来越高，因此发展出了以下先进样品制备方法。
1. 离子切割法离子切割法是用离子束制造纳米结构的一种新型制备方法。
该技术在常温下进行，尤其适合对生物样品进行纳米加工。
先利用离子束在样品表面制造一个几百纳米至几微米的V形切槽，再使用扫描电子显微镜或透射电子显微镜对切槽部分进行裂解，使其成为两个平行的翼片。
优点：样品制备过程中不存在溶剂和温度等对样品的影响。
缺点：需要比电子束切割等技术更高的技术要求，且需要显微镜等高端仪器的支持。
2. 离子束雕刻法离子束雕刻法是将离子束聚焦在样品表面发生物理和化学效应，制造出所需的凹凸形状，制备尺度小于100纳米的电子器件、纳米结构和生物体系的一种技术。
扫描电子显微镜生物样品制备和观察细胞生物学实验报告
扫描电子显微镜生物样品制备和观察细胞生物学实验报告实验目的：1.了解和掌握扫描电子显微镜（SEM）的基本原理和操作方法；2.掌握生物样品制备的基本技术；3.观察细胞的形态和结构。
实验器材：1.扫描电子显微镜；2.生物样品（如细胞培养物，植物片段等）；3.组织固定液（如PBS，甲醛等）；4. 缓冲液（如Na-cacodylate缓冲液）；5.高渗透液（如乙基醇）；6.导电性涂层（如金属薄膜）；7.脱水液（如丙酮）；8.SEM样品支架；9.电子显微镜图像分析软件。
实验步骤：1.样品固定和固定液去除a.取少量的细胞培养物或植物片段放入带有组织固定液的离心管中，固定液的浓度和反应时间可以根据实验需要来确定；b.在固定液条件下，将样品固定在一个特定的位置，确保样品在固定过程中不移动；c.将固定液倒掉，用缓冲液（如PBS）冲洗样品，以去除残留的固定液。
2.导电涂层和脱水a.将样品转移到一个干燥器皿中，加入导电涂层溶液，使样品表面均匀覆盖一层导电涂层；b.进行脱水过程，通常使用各种浓度的酒精（如乙醇）或丙酮作为脱水液。
3.样品固定在SEM样品支架上a.将样品放在SEM样品支架上，并用夹子将其固定；b.根据需要，可以在样品上覆盖一层金属薄膜以提高导电性。
4.样品装入扫描电子显微镜a.将SEM样品支架放入扫描电子显微镜的样品舱中；b.根据需要，可以进行微调或者变焦。
5.SEM图像获取和分析a.在扫描电子显微镜中选择适当的电压和电流，并调整对比度和亮度等参数；b.通过扫描电子显微镜图像分析软件，进行图像采集和分析；c.观察细胞的形态和结构，并记录相关的数据和观察结果。
实验结果：根据实验设定的条件和样品制备的方法，可以观察到细胞的形态和结构。
例如，可以观察到细胞的核、细胞质、细胞壁、纤毛等细微结构，通过比较和分析不同样品之间的差异，可以对细胞生物学进行进一步的研究。
实验注意事项：1.在样品制备过程中，要注意操作的干净和无菌，以防止外源性污染；2.在样品固定和处理过程中，要防止样品的移动和破损；3.在样品加入SEM样品支架之前，要确保样品已经完全脱水，并覆盖了足够的导电涂层；4.在SEM图像获取过程中，要注意合适的电压、电流和对比度等参数的设置，以保证图像的质量；5.实验过程中，注意正确使用SEM设备，遵守相关的安全规定。
电子显微镜样品制备与观察电子显微镜样品制备[1]
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电子显微镜样品制备与观察电子显微 镜样品制备[1]
2 支持膜的制备
（1）将玻璃条、250ml烧杯洗净，玻璃条先用纱 布擦干，然后再用绸布用力反复擦净，250ml烧 杯装满蒸馏水；
（2）将玻璃条放入0.2~0.3%聚乙烯醇缩甲醛的氯 仿溶液中2~4cm深，停留3~5s后提出，在空气 中自然干燥；
2 放入样品：按程序放入样品。 3 加高压：有下列几档可选 40KV、60KV、
80KV 、100KV，若需高压应先加低压。选择 加速电压原则：电压越高，分辨率越高，反差 越小；反之，电压越低分辨率越低，反差越大。
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电子显微镜样品制备与观察电子显微 镜样品制备[1]
4 加灯丝电源：顺时针旋转至限位处（加灯丝电 源必须有高压存在），此时应看到图象，若不 能看到图象，请与专职人员联系，切勿随意调 整各旋钮。 5 观察:调整放大倍数、亮度、样品 XY平移、焦距进行观察。
（五）实验要求 1 所用器具、工具保持清洁干燥； 2 手上若沾有环氧树脂，用丙酮棉球擦去； 每人包埋2～3个样品块。
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电子显微镜样品制备与观察电子显微 镜样品制备[1]
三、修快与支持膜的制备
（一）实验目的 1 掌握超薄切片包埋块修快的方法； 2 掌握支持膜制备的方法。 （二）实验原理 见理论部分 （三）实验材料 上次实验包埋的材料
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电子显微镜样品制备与观察电子显微 镜样品制备[1]
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2020/11/28
电子显微镜样品制备与观察电子显微 镜样品制备[1]干燥
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扫描电镜SEM样品制备
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
扫描电镜样品制备生物技术
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
tem透射电镜的样品制备方法
tem透射电镜的样品制备方法TEM（透射电子显微镜）是一种常用的高分辨率显微镜，可以观察到物质的结构和组成。
样品制备对于TEM观测至关重要，良好的样品制备可以提供高质量的显微图像。
以下是TEM透射电镜的样品制备方法的详细讨论。
1.样品选择：选择适合TEM观察的样品，典型的样品包括纳米材料、生物细胞、材料薄膜等。
根据需要选择合适的样品尺寸和形状。
2.样品固定：根据样品的特性和需要，采取合适的方法将样品固定在支撑物上。
常用的方法包括离心沉淀、滴定、蒸发浓缩等。
对于生物样品，可以使用化学固定剂（如戊二醛）进行化学固定。
3.样品切片：对于大尺寸或不透明的样品，需要将其切割成薄片，一般要求切片尺寸在100 nm以下。
常用的切片工具有超声切割仪、离子切割仪等。
切割样品时要注意样品的定位和定向，以确保观察到感兴趣的区域。
4.样品脱水：对于生物样品，需要将其进行脱水处理。
脱水可以使用乙醇和丙酮等有机溶剂，逐渐将样品中的水分替换为有机溶剂。
脱水过程中要避免剧烈振荡，以防止样品的破坏。
5.样品浸渍：将脱水后的样品浸渍在透明介质中，如环氧树脂或聚合物。
浸渍过程中需要避免气泡和异物的进入，以保持样品的质量。
6.样品调平：将浸渍后的样品放在平板上，用研磨纸将其调平。
调平过程中要注意避免样品的损坏。
7.样品切割：将调平后的样品切成适当尺寸的小块，便于后续的操作。
切割时要使用锋利的刀具，以保证切面的平整度。
8.样品研磨：使用研磨纸或研磨腰带对样品进行研磨，以使其表面更加平整。
研磨过程中要注意研磨力度的控制，以免样品的破损。
9.样品薄化：使用电子束或离子束对样品进行薄化处理，将其厚度控制在适当的范围内。
薄化过程中要注意能量和时间的控制，以避免样品的损坏。
10.样品清洁：最后，使用有机溶剂或气流将样品上的杂质去除，使样品表面干净。
以上就是TEM透射电镜的样品制备方法的详细讨论。
不同的样品可能需要不同的制备方法，需要根据实际情况进行调整。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电子显微镜生物样品制备与观察细胞生物学实验报告
扫描电子显微镜生物样品制备与观察细胞生物学实验报告实验目的：通过使用扫描电子显微镜（SEM），观察并比较不同生物样品的细胞结构和形态特征。
实验材料：-不同种类的生物样品（如植物叶片、昆虫翅膀、细菌培养物）-10%磷酸盐缓冲液（PBS）-2.5%葡萄糖溶液-电镜显微镜台-SEM样品支架-SEM扫描电镜实验步骤：1.收集各种生物样品，并用PBS润湿样品表面，以去除杂质。
2.将样品放置在SEM样品支架上，用细菌镊子小心地将样品固定在支架上。
3.将SEM样品支架放入SEM扫描电镜中，并调节扫描电镜的参数，如电子束的加速电压和信号放大倍数。
4.将SEM样品支架移动到扫描电镜中心位置，并确保样品表面与电子束的垂直距离适当。
5.打开电子束，在视野范围内找到有代表性的细胞区域，并通过调整焦距和扫描速度来获取清晰的图像。
6.在观察过程中，可以尝试不同的电子束参数，以获得最佳的样品成像效果。
7.观察并记录每个样品的细胞结构和形态特征，注意细胞的大小、形状和细胞器的位置等。
实验结果与讨论：通过SEM观察，我们可以清晰地看到植物叶片的气孔细胞和叶绿体的内部结构。
气孔细胞呈现出多边形的形状，并且表面布满微小的细管，这些细管是用于气体交换的通道。
叶绿体则呈现出椭圆形，并且具有叶绿素颗粒的特征，这些颗粒是光合作用中的关键结构。
昆虫翅膀的观察结果显示，翅膀表面有许多微小的鳞片组成，这些鳞片具有复杂的纹理和形状。
昆虫通过这些鳞片可以完成特定的功能，如飞行和保护。
SEM的使用使我们能够更加详细地观察到翅膀表面的微观结构。
细菌样品的观察结果显示，细菌呈现出不规则形状的胞体，表面光滑且有不规则的突起。
通过SEM的高放大倍数，可以看到细菌细胞壁的纹理和孔隙结构，这些结构可能与细菌的生长和代谢有关。
通过SEM观察不同生物样品的细胞结构和形态特征，可以增进我们对细胞生物学的理解。
SEM的高分辨率能力使我们能够观察到细胞的微观结构，从而对细胞的功能和相互作用有更深入的认识。
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电子显微镜生物样品的制备实验一、目的要求学习并掌握制备微生物及核酸电镜样品的基本方法。
二、电子显微镜与光学显微镜的主要区别显微镜的分辨率取决于所用光的波长，1933年开始出现的电子显微镜正是由于使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。
而光源的不同，也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异（表Ⅲ-1）。
表Ⅲ-1根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型，目前最常用的是透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜(scanning electron microscope)，前者总放大倍数可在1000~1000000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20~300000倍之间变化。
本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。
三、器材1.菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。
2.溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷钨酸钠（pH6.5~8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素c，醋酸铵，质粒pBR322。
3.仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。
四、操作步骤（一）透射电镜的样品制备及观察1.金属网的处理光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。
而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃，只能采用网状材料作为载物，通常称为载网。
载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是200~400目（孔数）的铜网。
网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。
本实验选用的是400目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。
如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸1~2分钟，或在1% NaOH 溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。
2．支持膜的制备在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜。
支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20nm；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右。
支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。
常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求，而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易，但强度不如聚乙烯甲醛膜。
（1）火棉胶棉的制备在一干净容器（烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放入一定量的无菌水，用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振动，待醋酸戊酯蒸发，火膜胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜。
用镊子将它除掉，再重复一次此操作，主要是为了清除水面上的杂质。
然后适量滴一滴火棉胶液于水面，火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关，待膜形成后，检查是否有皱折，如有，则除去一直待膜制好。
所用溶液中不能有水分及杂质，否则形成的膜的质量较差。
待膜成型后，可以侧面对光检查所形成的膜是否平整及是否有杂质。
（2）聚乙烯甲醛膜（formvar 膜）的制备①洗干净的玻璃板插入0.3% formvar溶液中静置片刻（时间视所要求的膜的厚度而定），然后取出稍稍晾干便会在玻璃板上便形成一层薄膜；②用锋利的刀片或针头将膜刻一矩形；③将玻板轻轻斜插进盛满无菌水的容器中，借助水的表面张力作用使膜与玻片分离并漂浮在水面上。
所使用的玻片一定要干净，否则膜难以从上面脱落；漂浮膜时，动作要轻，手不能发抖，否则膜将发皱；同时，操作时应注意防风避尘，环境要干燥，所用溶剂也必需有足够的纯度，否则都将对膜的质量产生不良影响。
3．转移支持膜到载网上转移支持膜到载网上，可有多种方法，常用的有如下二种：（1）将洗净的网放入瓷漏斗中，漏斗下套上乳胶管，用止水夹控制水流，缓缓向漏斗内加入无菌水，其量约高1厘米；用无菌镊子尖轻轻排除铜网上的气泡，并将其均匀地摆在漏斗中心区域；按2所述方法在水面上制备支持膜，然后松开水夹，使膜缓缓下沉，紧紧贴在铜网上；将一清洁的滤纸覆盖地漏斗上防尘，自然干燥或红外线灯下烤干。
干燥后的膜，用大头针尖在铜网周围划一下，用无菌镊子小心将铜网膜移到载玻片上，置光学显微镜下用低倍镜挑选完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。
（2）按2所述方法在平皿或烧杯里制备支持膜，成膜后将几片铜网放在膜上，再在上面放一张滤纸，浸透后用镊子将滤纸反转提出水面。
将有膜及铜网的一面朝上放在干净平皿中，置40℃烘箱使干燥。
4．制片透射电镜样品的制备方法很多，如超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法、滴液法等。
其中滴液法，或在滴液法基础上发展出来的其他类似方法如直接贴印法、喷雾法等主要被用于观察病毒粒子、细菌的形态及生物大分子等。
而由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等元素组成，散射电子的能力很低，在电镜下反差小，所以在进行电镜的生物样品制备时通常还须采用重金属盐染色或金属盐喷镀等方法来增加样品的反差，提高观察效果。
例如负染色法就是用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来对样品进行“染色”。
由于这些重金属盐不被样品万分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分，因而在样品四周有染液沉积的地方，散射电子的能力强，表现为暗区，而在有样品的地方散射电子的能力弱，表现为亮区。
这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。
负染色法由于操作简单，目前在进行透射电镜生物样品制片时比较常用。
本实验将主要介绍采用滴液法结合负染色技术观察细菌及核酸分子的形态。
（1）细菌的电镜样品制备①将适量无菌水加入生长良好的细菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。
用无菌滤纸过滤，并调整滤液中的细胞浓渡为108~109个/亳升。
②取等量的上述菌悬液与等量的2%的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌悬液。
③用菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
④经3~5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。
有时为了保持菌体的原有形状，常用戊二醛、甲醛、锇酸蒸气等试剂小固定后再进行染色。
其方法是将用无菌水制备好的菌悬液经过过滤，然后向滤液中加几滴固定液（如pH7.2，0.15%的戊二醛磷酸缓冲液），经这样预先稍加固定后，离心，收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并调整细胞浓度为108~109个/毫升。
然后按上述方法染色。
（2）核酸分子的电镜样品制备（图Ⅲ-7）核酸分子链一般较长，采用普通的滴液或喷雾法易使其结构受到破坏，因此目前多采用蛋白质分子膜技术来进行核酸分子样品的制备。
其原理是：很多球状蛋白均能在水溶液或盐溶液的表面形成不溶的变性薄膜，在适当的条件下这一薄膜可以成为单分子层，由伸展的肽链构成一个分子网。
当核酸分子与该蛋白质单分子膜作用时，会由于蛋白质的氨基酸碱性侧链基团的作用，使得核酸从三维空间结构的溶液构型吸附于肽链网而转化为二维空间的构型，并从形态到结构均能保持一定程度的完整性。
最后将吸附有核酸分子的蛋白质单分子膜转移到载膜上，用负染等方法增加样品的反差后置电镜观察。
可用展开法、扩散法、一步稀释法等使核酸吸附到蛋白质单分子膜上，本实验采用展开法。
图Ⅲ-7①将质粒pBR322与一碱性球状蛋白溶液（一般为细胞色素c）混合，使浓度分别达到0.5~2 mg/ml和0.1mg/ml，并加入终浓度为0.5~1mol/L的醋酸铵和1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，成为展开溶液，pH为7.5。
②在一干净的平皿中注入一定下相溶液（蒸馏水或0.1~0.5mol/L的醋酸铵溶液），并在液面上加入少量滑石粉。
将一干净载玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液枪吸取50μl的展开溶液，在离下相溶液表面约1cm左右的载玻片上前后摆动，滴于载玻片的表面，此时可看到滑石粉层后退，说明蛋白质单分子膜逐渐形成，整个过程约需2~3min。
载玻片倾斜的角度决定了展开液下滑至下相溶液的速度，并对单分子膜的形成质量有影响，经验证明倾斜度以150左右为宜。
在蛋白形成单分子膜时，溶液中的核酸分子也同时分布于蛋白质基膜中间，并略受蛋白质肽链的包裹。
理论计算及实验证明，当1mg的蛋白质展开成良好的单分子膜时，其面积约为1cm2，因而可根据最后形成的单分子膜面积的大小估计其好坏程度。
如果面积过小，说明形成的膜并非单分子层，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危险，使整个核酸分子消失或反差变坏。
在单分子膜形成时整个装置最好用玻璃罩等物盖住，以防操作人员的呼吸和旁人走动等引起气流的影响以及灰尘等脏物的污染。
另外，在展开溶液中可适量加入一些与核酸量相差不过悬殊的指示标本，如烟草花叶病病毒等，以利于鉴定单分子膜的展开及后面转移的好坏。
③单分子膜形成后，用电镜镊子取一覆有支持膜的载网，使支持膜朝下，放置于离单分子膜前沿1cm或距载玻片0.5cm的膜表面上，并用镊子即刻捞起，单分子膜即吸附于支持膜上。
多余的液体可用小片滤纸吸去，也可将载网直接漂浮于无水乙醇中10~30s。
④将载有单分子膜的载网置于10-3~10-5mol/L的醋酸铀乙醇溶液中染色约30s（此步可在用乙醇脱水时同时进行），或用旋转投影的方法将金属喷镀于核酸样品的表面。
也可将二种方法结合起来，在染色后再进行投影，其效果有时比单独使用一种方法更好一些。
5.观察将载有样品的铜网置于透射电镜中进行观察。
（二）扫描电镜微生物样品的制备及观察扫描电镜观察时要求样品必需干燥，并且表面能够导电。
因此，在进行扫描电镜微生物样品制备时一般都需采用固定、脱水、干燥及表面镀金等处理步骤。
1.固定及脱水生物样品的精细结构易遭破坏，因此在进行制样处理和进行电镜观察前必需进行固定，以使其能最大限度地保持其生活时的形态。
而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醇等对样品进行梯度脱水，也是为了在对样品进行干燥处理时尽量减少由表面张力引起的其自然形态的变化。
将处理好的、干净的盖玻片，切割成4~6mm2的小块，将待检的较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上，或将菌苔直接涂上，也可用盖玻片小块粘贴菌落表面，自然干燥后置光学显微镜镜检，以菌体较密，但又不堆在一起为宜；标记盖玻片小块有样品的一面；将上述样品置于1%~2%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2左右）中，于40C冰箱中固定过夜。
次日以0.15%的同一缓冲液冲洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15min。