电镜切片样品制作步骤
透射电镜生物样本制备流程及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。
它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。
然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。
下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。
一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。
常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。
2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。
通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。
3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。
二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。
超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。
2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。
离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。
三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。
2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。
通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。
这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。
3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。
树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。
四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。
透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。
为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。
下面将详细介绍透射电镜制样的流程。
1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。
首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。
样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。
制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。
2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。
常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。
然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。
3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。
使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。
切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。
4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。
这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。
脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。
5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。
嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。
然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。
6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。
使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。
切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。
7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。
这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。
8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。
透射电镜样本的制备
喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的
喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。 喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。 但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗 费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故 此法不常用。
漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴 上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的 液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜 网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。
负染
阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首 先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨酸 染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的 "空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染 色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现 黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正 染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高 的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结 果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。 两者之间的反差正好相反，故称为负染色
H2O
90% 丙酮
15min
100% 丙酮
20min 20min
浸透和包埋
通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂， 使其渗透到组织细胞中去
以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的 固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的 作用，有利于超薄切片。
丙酮：包埋剂 2：1 丙酮：包埋剂 1：1 纯包埋剂 包埋
5mL 10mL 20mL 30mL 40mL 50mL
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
电镜样品处理
样品处理步骤：
样品包埋
1、将组织切成
的小快儿，立即投入3%的戊二醛固定液
中，抽气直到组织块完全进入固定液，4摄氏度固定过夜。
2、经PBS充分洗涤（离心管中洗10次，每次15分钟），用0.1%
的锇酸后固定，25摄氏度，2小时
3、换离心管用0.1M PBS充分洗涤（洗10次，每次15min），乙醇
系列脱水，每次10min；纯丙酮过度，3次，每次10min。
4、浸透，0、5ml Spurr树脂+5滴丙酮
5、包埋：70摄氏度聚合
6、制超薄切片
7、切片捞在100目0.3%Formvar膜覆盖的镍网上。
染色
用2%的醋酸铀25摄氏度染色10min，用重蒸水洗3次，每次20min 再用柠檬酸铅25摄氏度染色5min，用重蒸水洗三次，每次20min。
电镜观察。
TEM电镜样品制作程序(新)
TEM电镜样品制作程序一、试剂1．磷酸缓冲液（Milloning p buffer）A液：2.53％NaH2PO4.2H2O水溶液41.5mlB液：2.52％NaOH水溶液8.5ml （0.3M, 50ml, pH7.3）2. 固定液1). 戊二醛（4％）：25％戊二醛原液16ml＋DDW 50ml，摇匀后加p buffer 50ml，终pH7.0~7.42).锇酸（四氧化锇）：配原液：1g＋50ml DDW 2％配固定液：2％原液/p buffer＝1/13.4. 染色液1).醋酸铀饱和乙醇溶液：醋酸铀5g,乙醇50ml2).柠檬酸铅染液：硝酸铅1.33g，柠檬酸钠1.76g，DDW 30ml二、常规操作步骤【第一天】取材取各组小白鼠♀♂各一只，处死后立即取小肠（消化管取材不应斜切，剪开管腔使之成片状，平铺，黏膜面朝上，最好将其四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面『注意：快，准，轻，小，冷』固定（前固定）戊二醛固定3～4h(可在戊二醛中长期保存--几周甚至1~2个月)『注意：固定液的酸碱度必须与被固定的组织的酸碱度基本保持一致，大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4』用p buffer洗一次，共3次，后过夜【第二天】固定（后固定）向样品中加入0.2ml p buffer和0.2ml锇酸(共0.4ml,可事先在通风厨内配好)，2h后用p buffer清洗样品(在通风厨内操作)『样品可在p buffer中保存』配包埋剂(大约需1h，每加入一种试剂需搅拌15min)脱水（丙酮系列）30％，50％，70％，80％，90％（各一次，15min/次），无水丙酮（2次，10min/次）『注意：脱水要彻底；若当天不能完成浸透、包埋操作，应将样品停留在4℃，70％乙醇或丙酮中过夜；脱水动作尽量要快，特别是100％脱水剂，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥』配下一步浸透用的丙酮/树脂(1/1,1/2)浸透（丙酮－树脂）丙酮/树脂＝1/1，浸透1h（0.2ml,0.2ml）丙酮/树脂＝1/2，浸透1h（0.2ml,0.2ml+0.2ml）纯树脂，浸透（2h后即可包埋，也可隔夜再包埋）包埋树脂加满样品槽，呈凸面，标签纸放中间，样品放两边『注意：包埋剂用前不能搅拌，以免产生气泡。
透射电镜样品制备步骤
透射电镜样品制备步骤透射电镜是一种重要的材料表征技术，它利用电子的波动性和微粒性来观察材料的结构和性质。
为了能够使用透射电镜观察样品，首先需要对样品进行制备。
透射电镜样品制备步骤如下：1.选择合适的样品：透射电镜样品可以是固体、液体、薄膜或纳米颗粒等。
根据研究目的和样品性质选择合适的样品。
2.样品预处理：根据样品性质的不同，进行必要的预处理。
例如，对于固体样品，可以选择切割、抛光或电解抛光等方法来得到平滑的表面。
3.样品固定：将样品固定到透射电镜样品架上。
不同的样品有不同的固定方法。
例如，对于固体样品，可以使用导电胶将其固定在样品架上。
4.薄层制备：对于厚度过大的样品，需要将其制备成透明的薄层以便透射电镜观察。
常用的方法有机械研磨、电子束刻蚀或离子束刻蚀等。
5.样品清洁：将样品放入超声波清洗机中进行清洗，以去除可能附着在样品表面的杂质或污染物。
6.特殊处理：如果需要对样品进行特殊处理，例如加热、冷冻处理或受到特定环境气氛的影响等，根据需要进行相应的处理。
7.样品干燥：将样品放入真空或氮气环境中，以确保样品干燥。
避免样品受到水汽的污染。
8.获得薄片：使用切片机将固态样品切割成适当厚度的薄片。
为了获得高质量的薄片，可以选择特殊的切片工具和技术，例如离子束切片或低速钻磨切片。
9.薄片形状整理：使用不同的研磨和抛光方法，将薄片的形状和表面进行调整，以确保样品的平滑度和一致性。
10.网格制备：将薄片粘贴在透射电镜网格上。
网格可以增强样品的稳定性和保护，同时提供用于定位和标识的标记。
11.后续处理：根据研究目的和透射电镜分析的要求，可以对样品进行进一步处理。
例如，可以进行染色、脱膜、溅射或腐蚀等处理。
以上是透射电镜样品制备的一般步骤。
不同样品和研究目的可能会有所不同。
因此，根据具体的研究需求和样品特点，制备过程可以做相应的调整和优化。
电镜切片样品制作步骤知识讲解
A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。
B贴壁培养的细胞：在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。
SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。
C组织取材样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右；样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。
能够明确标识标本的观察面。
消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。
如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。
附：2.5%戊二醛的配制Step 1:0.2M磷酸缓冲液的配制：---------------------磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克双蒸馏水加至500毫升pH调至7.4Step 2:戊二醛固定液的配制：---------------------25% 戊二醛1ml双蒸馏水4ml0.2mol/L磷酸缓冲液5ml戊二醛最终浓度 2.5%pH值7.3-7.4一、培养细胞✧本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。
1.细胞数量：106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。
2.离心收集：消化或用细胞刮刮下细胞。
如细胞状态一般或漂浮物较多，建议更换新培养基；如观察自噬，建议刮下细胞。
3.离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义，时间在5min内；4.细胞团大小：细胞最厚处约0.5~1.5mm,或者参照1元硬币的厚度；5.细胞离心成团后去除上清，加2.5%电镜用戊二醛500μl固定，切勿吹悬，室温1h，4℃3 h后，去除戊二醛加满PBS后4℃放置或送检。
透射电镜细胞样品制备流程
透射电镜细胞样品制备流程以透射电镜细胞样品制备流程为标题，我们来介绍一下这个过程。
透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种高分辨率的显微镜，可以用来观察非常微小的细胞结构和内部细节。
为了获得高质量的透射电镜图像，样品的制备非常重要。
下面我们将详细介绍透射电镜细胞样品制备的流程。
第一步，收集细胞样品。
可以选择不同类型的细胞样品，如动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
细胞样品可以从生物实验室中获得，也可以通过培养细胞来获取。
第二步，固定细胞样品。
固定是为了保持细胞在制备和观察过程中的形态和结构。
常用的固定剂有乙醛、戊二醛等。
将细胞样品与固定剂混合，使细胞膜和细胞器固定在原位，停止细胞内部的生化反应。
第三步，脱水样品。
将固定的细胞样品通过一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理。
脱水的目的是去除细胞内外的水分，使样品适合后续的浸渍和包埋。
第四步，浸渍和包埋样品。
将脱水后的细胞样品置于透明的有机溶剂中，如丙酮或环氧树脂。
浸渍的目的是使样品与嵌入剂之间充分接触，逐渐将有机溶剂替换为嵌入剂。
然后将样品转移到嵌入剂中，使细胞样品被完全包裹在固体嵌入剂中。
第五步，切片样品。
使用超薄切片机将包埋的细胞样品切成非常薄的切片，一般为50-100纳米。
切片的过程需要非常小心和精确，以确保切片的质量和一致性。
第六步，上膜样品。
将切好的细胞样品转移到透明的膜上，如碳膜或铜膜。
上膜的目的是增强样品的稳定性和导电性，以便在透射电镜中观察。
第七步，染色样品。
可以使用染色剂来增加样品的对比度和可见度。
常用的染色剂有重金属盐（如铋盐）和阴离子染料（如尼格罗红）。
染色的过程需要小心操作，以避免染料的过度使用或样品的损坏。
第八步，干燥样品。
将上膜和染色后的样品放置在通风设备中，使其自然干燥。
干燥后的样品可以储存在干燥剂中，以保持其稳定性和保存时间。
将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
通过透射电镜，我们可以获得高分辨率和高对比度的细胞图像，从而更好地研究细胞的结构和功能。
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扫描电镜样品的准备
A悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；
细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量
2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。
B贴壁培养的细胞：
在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。
SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。
C组织取材
样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右；
样品表面在固定前必须清洁：
使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。
能够明确标识标本的观察面。
消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。
如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定
2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。
附：
2.5%戊二醛的配制
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO 4.H2O）
2.6xx
磷酸氢二钠(Na2HPO
4.12H2O)29xx
双蒸馏水加至500毫升pH调至
7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25%戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度
2.5%
pH值
7.3-
7.4
透射电镜样品的制备
一、培养细胞
本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。
1.细胞数量：106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。
2.离心收集：
消化或用细胞刮刮下细胞。
如细胞状态一般或漂浮物较多，建议更换新培养基；如观察自噬，建议刮下细胞。
3.离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义，时间在5min内；
4.细胞团大小：
细胞最厚处约
0.5~
1.5mm,或者参照1元硬币的厚度；
5.细胞离心成团后去除上清，加
2.5%电镜用戊二醛500μl固定，切勿吹悬，室温1h，4℃3 h后，去除戊二醛加满PBS后4℃放置或送检。
注意：
固定细胞不需要吹悬，细胞不宜过多，过多会导致固定液无法迅速渗透到底部细胞；
二、生物组织
迅速剪下/切下相应位置，在
2.5%戊二醛中，依据不同组织和实验目的，用刀片修成1mm3的小块或
__mm2×2mm长条或薄片状。
在
2.5%戊二醛室温1h，4℃3h，去除戊二醛加满PBS，4℃放置或送检。
标本固定时，尽量修饰成合适的形状，对于需要定位的标本，离开实验室者后比较难以确认所需要的位置。
使用2ml圆底或尖底的EP管，勿用500μl以下的EP管。
块状标本基本包含的组织类型：
脑、肾、肝、肺、心肌；
长条状、薄片状标本基本包括：
骨骼肌、平滑肌：
肌纤维方向与标本长轴平行或垂直（送样时说明方向）
皮肤、毛囊：
皮肤角质层与长轴平行；
神经、直径在2mm内的小血管：
其长轴与标本块长轴平行的长条
消化道、大血管：
长条片状，一侧是上皮、内皮细胞面，或依据目的去除无用的分层脑皮质、海马、耳蜗等：
具有方向性或需横切或纵切面或需要组织中某一特定位置的标本；
具体到某些组织，可能会有不同的要求，如观察海马CA1区，建议标本取片状或近似三角形的片状或梯形（比较好）。
直观的说，小块直径约为1元硬币厚度；长度的短轴约为1元硬币的厚度；具体大小根据标本会有相应的调整，但都已小尺寸为佳。