比色法和分光光法
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
比色法和分光光度法的基本知识
比色法和分光光度法的基本学问**节比色法和分光光度法的基本学问一、光的特性光是由光量子构成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。
波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：λ＝C/V式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。
Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。
Ｃ为光速等于299770千米／秒。
光属于电磁波。
自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1—1所示的波谱图。
分光光度法所使用的光谱范围在200nm—10μ（1μ=1,000nm）之间。
其中200nm－400nm为紫外光区，400nm －760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。
二、光的互补色假如两种色光（单色光或复色光）以适当地比例混合而能产生白色感觉时，则这两种颜色就称为“互为补色”。
非发光物体的颜色（如颜料），重要取决于它对外来光线的汲取和反射，所以该物的颜色与照射光有关。
一般把物体在白昼光照射下所呈现的颜色称为该物体的颜色。
假如将白昼光照射在黄蓝两种颜色混合后的表面时．因黄颜料能反射白光中的红、橙、黄和绿四种色光，而蓝色光能汲取其中的红、橙和黄三种色光，结果使混合颜料显示绿色。
这种颜色的混合与色光的加色混合不同，三、光的选择性汲取物质对光的汲取是物质和光能相互作用的一种形式。
由于光的波粒二象性只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被汲取，而物质的基态和激发态是由物质的原子结成和原子间相互作用决议的，不同的物质的能态不同，对光的选择性汲取也就不一样。
所以物质对光具有选择汲取性。
要讨论光的选择性汲取，首先必需搞清楚其产生的机理。
原子是由质子和核外电子构成的，核外电子以不同速度在质子四周不同轨道上旋转，每个轨道的能级是不一样的。
好像卫星围绕地球转的情况是相像的。
同时，每个轨道又有方向不同的亚轨道，而同一轨道的不同亚轨上的能量也是不相同的。
当电子的运动轨道更改都会伴有汲取和释放能量。
所以不同的能量变化有不同的汲取光谱。
比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
2
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目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
2.2目视比色与分光光度计
光屏
M1
发生衍射和干涉现象而 分光.
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
检测器
h Au，Ag Ag、Au
半导体
Se
硒光电池
光电管
碱金属 光敏阴极
h Ni环（片）
红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
光电倍增管 160-700 nm
待扫描
1个光电子可产生106～107个电子
23
用于药物的鉴别、杂质检查 （紫外分光光度法）
• 1．吸收曲线：每一种物质对不同波长光 的吸收程度是不同的 。如果我们让各种 不同波长的光分别通过被测物质，分别 测定物质对不同波长光的吸收程度。以 波长为横坐标，吸收程度为纵坐标作图 所得曲线。
24
例：丙酮 max = 279nm ( =15)
3.2 理化法-比色分析法 一、 光度分析的几种方法
1.目视比色法
观察方向
比 色 管
cc2 1
c1
c2
c3
c3
c4
c4
用眼睛观察比较标准液和待测液的颜色测其含量。 方法方便、简单，准确度差（相对误差约为5%～ 20%）。常用于限界分析，如药物的杂质检查。 1
2. 吸光光度法和分光光度计
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光，波 长可调。根据波长范围不同，可分为可见分光光 度计和紫外分光光度计。 特点： ①灵敏度高，可达10-4g•ml-1—10-7g•ml-1； ②准确度高，相对误差为2％—5％；
Fe%=[(5×10-6×50×100/5)/0.3866]×100％ ＝0.026％
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紫外分光光度法在药物含量测定中的应用
测定方法 测定时，应以配制供试品溶 液的同批溶剂为空白对照（通常吸收池 和溶剂本身有吸收，应扣除）。一般供 试品溶液的吸收度读数，以在0.3—0.7之 间的误差较小。 E1%1cm：指在一定波长下，溶液浓度 (C)为1％(W/V)，l＝1cm时的吸收度。
第二十章 比色法和分光光度法
3、朗伯-比尔定律
4、透光度（透射比） 5、吸光系数（吸收系数） 6、摩尔吸收系数
书P398： 例题20-1
二、吸光度的加和性 测得溶液的吸光度等于各组分的吸光度之 和。 A总 = ∑ Ai ＝κ1 b c1 + κ2 b c2 + …… κn b cn
三、朗伯-比尔定律的偏离 1、比尔定律的局限性 2、非单色入射光引起的偏离
4、颜色的产生：物质对不同波长的光具有选
择性吸收作用而产生了不同颜色。
5、光吸收曲线 6、吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
7、物质定性分析的依据：不同物质的溶液，
其最大吸收波长不同。
20.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定 1、朗伯定律 朗伯(Lambert) 1760年阐明了光的吸收程 度和吸收层厚度的关系。 A∝b 2、比尔定律 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度 和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A∝ c
一、光度分析法的特点 1、灵敏度高 2、准确度能满足微量组分测定的要求 3、操作简便快速，仪器设备简单
二、物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光称为单色光。 2、复合光：由不同波长的光组成的光称为复
合光。如可见光。 3、互补色光：两种适当颜色的单色光按一定 强度比例混合可成为一种白光，这种两种单 色光称为互补色光。
A
λ1 A
λ2
λ
λ1
λ2
λ
Aλ1= kaλ1bCa ＋kbλ1bCb Aλ2= kaλ2bCa ＋kbλ2bCb
三、光度滴定 四、酸碱解离常数的测定 五、配合物组成的测定 1、饱和法 2、连续变化法
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
分析比较目视比色法和分光光度法
分析比较目视比色法和分光光度法目视比色法和分光光度法都是常见的实验室酸碱测定方法之一，它们具有易操作、灵敏度高、设备简单等特点，因此普遍应用于药物和食品分析领域。
两种方法各有特点及使用区别，本文将分析比较这两种方法的不同点，为两种方法的运用提供参考。
首先，来自于二者的原理：目视比色法基于酸碱指示剂的色谱变化来合成检测酸碱度。
大多数指示剂在某一范围酸碱度值内变化色谱来表示酸碱度，由此可更直观地检测溶液的酸碱程度。
而分光光度法是认为根据不同浓度环境下有机物的光谱吸收特性，针对影响酸碱度溶液的组分，把其选定最佳紫外光谱吸收波数，结合特定的酸碱指示剂检测溶液的PH 值。
因此可以认为，目视比色法的原理是根据酸碱指出剂色谱的变化，而分光光度法是借助特定指示剂测量溶液的吸光度以及紫外吸收特性。
其次，从实际操作上来看，有些明显的区别。
使用目视比色法时，首先需要准备一些酸碱指示剂悬浮液，然后在标准玻璃比色杯内量取被检测溶液，并加入适量的指示剂，当被检测溶液与指示剂混合时，即可出现典型的比色条带，通过比较比色条带的色彩深浅，即可间接的推测出溶液的酸碱度范围。
而使用分光光度法时，首先需将酸碱指示剂浓度稳定后，再添加相应溶液，通过溶液中有机物紫外吸收比对着色体紫外吸收光谱特征，然后通过取舍紫外吸收光谱仪湿润以及滨值，来计算溶液的酸碱度。
最后，在结果稳定性方面，基于以上介绍可得知，目视比色法更加依赖于操作者的经验以及眼力，若不加以严格控制，操作者看到的酸碱度或会有较大的偏差，因此对结果的稳定性比较差。
而分光光度法更加严谨，结果准确稳定，而且分析速度很快，更适用于批量测定。
综上所述，目视比色法和分光光度法的原理基础不同，在操作上也有较大的差异，两者属于不同的测定技术，各有优势，在不同的场合会选择不同的分析方法使用，根据检测条件确定对应的检测方法，确保最终结果的精准可靠性。
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即： A lg I0 lg 1 kb
I
T
A为吸光度; I0为入射光强
I为透过光强; T为透光度
I0
I
k’为比例常数
b为液层厚度（光程长度） b
➢ 比耳（Beer）定律：
一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与 吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：
A lg I0 kc I
价电子能级的能量＋振动能级的能量＋转动能级的能量 能级差与对应的光谱
价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。
吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发
工作曲线（标准曲线）：
测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一 曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比。 ➢理想情况下工作曲线过原点； ➢直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要 求两个数量级以上的线性范围； ➢样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。
偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。
2. 分光光度计的基本部件
检
结
光 源
单 色 器
吸 收 池
测 系 统
果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000um 10um
波 长
100nm 10nm
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm 橙 590 － 620nm 黄 570 － 590nm 绿 550 － 570nm 青 495 － 550nm 蓝 450 － 495nm 紫 380 － 450nm
第二十章 比色法和分光光度法
20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法
20.1 概述
20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： ➢ 灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 ➢ 准确度高。相对误差2－5％。 ➢ 仪器设备简单、操作简便。 ➢ 应用范围广。
➢ 朗伯-比耳定律：A kbc
当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸
光系数，其单位为cm-1mol-1L。
A bc
的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。
A bc
思考：摩尔吸光系数如何测定？
朗伯-比耳定律的适用范围： ➢不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光 物质和固态吸光物质； ➢它是各种吸光光度法定量分析的依据。
吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，被吸收的光的比例。
吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射 光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。
最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱 曲线上的最大峰值。
Absorbance(AU)
0.6 1 0.5色散元件、聚焦透镜 和出射狭缝构成。
➢玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长 范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ） 则可用于整个紫外-可见光区。
➢光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围 宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而 产生相互干扰。
190－400nm
2. 可见光吸收光谱
➢单色光：单一波长光 黄
➢复合光：复合波长光
绿 青
➢互补光：处于同一直
线上的两种光。
橙
白光
青蓝
➢互补光按一定强度比 例混合，即得白光。
➢溶液颜色：互补光的 颜色。
红
蓝
紫
光的互补色示意图
3. 吸收光谱曲线
透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。
态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以
光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。
紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，
从基态跃迁到激发态。
20.2 光吸收定律
➢ 朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的
溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。
吸收池（比色池、比色皿）： ➢用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 ➢因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 ➢杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差。 检测系统：
0.3 4
0.2
0.1
2
0
-0.1
190
240
290
340
390
wavelength(nm)
四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图
1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯
4. 物质吸收光的本质
物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动；
分子自身的转动。 分子的能量
20.3 比色法和分光光度法及其仪器
1. 光度分析方法 ➢ 目视比色法： ➢ 光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的
吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光； ➢ 分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准 溶液的吸光度。
分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。
偏离比耳定律的原因：
比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无 相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略。
入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件（单色器） 很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带， 而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。
化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、 悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增 大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。