膜片钳技术SOP
膜片钳技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术的基本原理二、用一个尖端直径在~μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。
三、基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。
膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。
四、二、操作步骤1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。
膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)
Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
————————
细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
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膜片钳技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术的基本原理用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。
基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。
膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。
二、操作步骤1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。
玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。
电压钳制和膜片钳制技术 (2)
第四页
(一) 细胞膜的等效电路
从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻
－电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻，Ro），
膜电阻（横向电阻，Rm），膜电容（Cm）和膜电
位（Em）四方面的电学特性，根据这四方面特性
即可构成其等效电路（Equivalent Circuit）。
第五页
outside
第二十页
(二)电压钳方法
电容器电流 Ic=d（CmV）/dt
电阻器上电流
IR
流过膜的电流总量 I
dv / dt = 0
所有的电流将都是流过膜 电阻的，这种电流将能反映离 子的流动。
第二十一页
电压钳技术的基本原理
电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放大器 （AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连接，这一反
I m = Ic + Ir
第十五页
5 膜电流（membrane current）
电位的变化引起膜电容的充电或放电，而 电流的变化则表现在膜电阻上的电流流动。 Ic只在膜电位发生变化的一瞬间出现，若将膜 电位固定在一定水平，记录到的仅为Ii（Ir）， 这是电压钳制技术的电学基础之一。
第十六页
(二) 细胞膜的时间常数（time constant）
第十八页
二、电压钳制技术的方法原理
(一)、定义
利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定于 某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中的离 子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。
第十九页
电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内将跨膜
电位（Transmembrane Potential， Vm），保持在某个选 定 的 电 位 水 平 ， 此 电 位 称 为 保 持 电 位 （ Holding potential，Vh），或者使保持电位突然变到某个特定 的 幅 值 的 方 波 电 位 ， 称 为 钳 制 电 位 （ Clamping potential）或指令电位（Command potential，Vc）。
膜片钳系统简明操作规程
膜片钳系统简明操作规程1.准备（1）相关液体：大部分细胞外液的pH为7.4，电极内液的pH为7.2-7.3；培养细胞的缓冲体系为HEPES，而急性分离细胞或者组织切片的缓冲体系多为碳酸盐体系；至于渗透压，细胞内应高于细胞外（如340mOsmd: 330mOsmd）使细胞微肿胀从而利于封接。
所有液体均应用微孔滤膜过滤，ICS应冻存；如果采用碳酸盐体系，那么实验过程必须灌流。
（2）电极：所用电极控制在2-5MΩ，电阻值越大则tip越细，利于封接而不利于破膜，反之，电阻值越小则tip越粗，利于破膜而不利于封接（注意小细胞有时电极电阻也可大于5MΩ）；电极直径最好为5-10μm，即对于400倍的显微镜下2-4mm；电极末端可用火烧平，防止刮掉氯化银。
2. 封接准备（1）打开Clampex的Membrane Test，设定封接测试脉冲电流方波的幅度和频率。
（2）在玻璃微电极内维持一定的正压，用微操作器使电极进入记录液，在Membrane Test中可见测试脉冲方波，观察电极电阻大小。
（3）关闭Membrane Test，用Auto调节Pipette Offset，使METER 中的I （pA）=0。
如果I不显示为0，则可继续手工精确调节补偿的失调电位数值，直至I为0。
3. 封接（1）打开Membrane Test，使玻璃微电极逐渐接触细胞，去除正压并轻轻给予负压以形成稳定封接。
此时，封接测试脉冲消失，仅出现电极电容瞬变值。
封接电阻在1GΩ以上。
（2）补偿电极电容：用Cp Fast和Cp Slow对电极电容进行补偿。
可选Leak Subtraction去除漏电流。
4. 破膜（1）继续给予负压活用Zap功能电击打破细胞膜。
出现膜电容放电。
缓慢撤除电机内负压。
（2）用Auto对膜电容进行补偿，必要时手工进行细微调节。
（3）进行串联电阻补偿：选上Rs Compensation和Disable if oscillation detected，增大Prediction和Compensation对串联电阻进行补偿。
膜片钳技术SOP
膜片钳技术SOP关键词：膜片钳目的：研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。
基本原理：膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。
通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。
运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。
膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。
只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。
膜片钳技术原理示意图Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。
Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。
此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂：根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。
主要仪器设备与材料：①屏蔽防震实验台(TMC 63-544)②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China）③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan）④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan）⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan）⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A）⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany）⑧计算机（PⅢ 800）⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A）⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A )实验对象：兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。
常州细胞生物学脑定位膜片钳原理及步骤
常州细胞生物学脑定位膜片钳原理及步骤
常州细胞生物学脑定位膜片钳是一种用于记录神经元电活动的实验技术。
其原理为利用微型电极穿透细胞膜，直接记录细胞内外电位的变化，并通过程序控制电极的移动，定位到特定的神经元细胞上进行电生理实验分析。
具体步骤如下：
1. 制备膜片钳：制作玻璃微电极，并用火炬加热封闭一端，使其呈现一个微小的孔。
将另一端连接到电极放大器上。
2. 切取小鼠或大鼠脑组织：将小鼠或大鼠的脑组织切成薄片，并将其置于离心管中。
加入缓冲液处理，使脑片柔软并不断吸除液，去除脑组织中的血液和细胞间液。
3. 将片段放在实验器皿中：将制备好的膜片钳放入实验器皿中，将离心管中的脑片放在显微镜下，观察和定位神经元的位置。
4. 穿透细胞膜：通过微调玻璃微电极的位置，将其穿透神经元细胞膜，并记录细胞内外的电位变化。
5. 进行电生理实验：利用程序控制电极的移动，将膜片钳定位到具体的神经元细胞上进行离子通道电流和电势信号的测量。
6. 分析细胞电生理数据：通过数据分析软件对实验结果进行分析，了解神经元细胞的电生理特性和响应情况。
7. 记录实验结果：将数据记录下来，并用图表等方式展示实验结果，以便后续研究或发表论文。
膜片钳技术
膜片钳技术1、膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术的原理图[51]Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。
RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。
此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。
实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。
本实验采用的是全细胞记录模式。
全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。
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膜片钳技术SOP关键词：膜片钳目的：研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。
基本原理：膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。
通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。
运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。
膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。
只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。
膜片钳技术原理示意图Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。
Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。
此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂：根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。
主要仪器设备与材料：①屏蔽防震实验台(TMC 63-544)②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China）③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan）④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan）⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan）⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A）⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany）⑧计算机（PⅢ 800）⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A）⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A )实验对象：兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。
动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。
本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。
实验环境：常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%）操作步骤：1.液体配制主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。
包括：电极液；细胞外液等。
基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。
另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。
（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015）2.标本制备膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。
实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。
常用的酶是胶原酶和蛋白酶，单独或联合使用，有些组织还要加用其它酶，如弹性纤维酶等。
（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015）3.微管电极的制备一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在1~2μm之间，抛光与涂布液体硅酮树酯后，充灌电极液。
3.1微管电极拉制电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中间拉成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成两根。
调节第一步和第二部拉制时的加热线圈电流，就可得到所需要的尖端直径。
拉制电极的毛细玻璃管(Hematocrit Tubes，Drummond,U.S.A.)长度约为75mm。
首先设定电极两步拉制参数: 第一步为59mA，第二步为54mA; 然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉制仪上。
经过两步拉制后电极尖端直径约为1~2μm，充灌电极液后电极阻抗为2~4 MΩ。
3.2绝缘树脂涂抹为了克服热噪声和封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容噪声，需要在微电极尖颈部（距微电极尖端50nm）的表面薄薄地涂一层硅酮树脂，将涂好的电极移放到镍铬电阻线圈制成的电炉上烘干待用。
3.3电极热抛光将两步拉制成的电极置于MF-83微管电极抛光仪的垂直推进架上，在低倍镜下（15×4）找到电极尖端和加热电阻丝，然后换成高倍镜（15×33）。
将加热电阻丝和电极尖端调整到一个平面内，进行瞬间加热，可使电极尖平滑并烧去多余的硅酮树脂薄层，使电极尖端圆钝平滑有利于高阻封接的形成。
3.4电极液充灌用注射器反向充灌，即用拉细的聚乙烯胶管从电极尾部插入到电极尖端，再注入溶液。
充灌后用左手夹住电极使其尖端向下，用右手指轻弹电极排出电极尖端的少许气泡。
4.高阻抗封接形成4.1在恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中。
浴槽不能太深，以尽量减少电极进入浴液的深度，从而减少浮游电容；4.2倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验；4.3使用新拉制的微管电极，用细塑料管以反充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指敲弹几下管壁即可排除，然后再将微电极安装在探头上。
4.4当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极施加一正压（1~2cm H2O），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上pipette offset旋钮，将电极电压补偿到零。
同时由膜片钳放大器向微管电极发放—电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程。
4.5微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负压（10~20cm H2O），若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10~100GΩ，说明高阻抗封接（giga seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。
在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类型的膜片构型。
5.膜片钳制技术记录方式5.1细胞贴附式膜片（cell-attached patch）由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端而得名。
它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。
优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。
可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。
缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。
同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。
5.2内面向外式膜片(inside-out patch)细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。
特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。
但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。
应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。
这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。
5.3外面向外式膜片(outside out patch)细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。
优点：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。
缺点：实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。
应用：可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。
5.4全细胞记录构型(whole cell recording)在细胞贴附式膜片形成的基础上，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，而高阻封接稳定，即形成全细胞记录构型。
记录的电流属于宏观电（macroscopical current），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。
若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。
特点：①电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；②记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；③适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30μm的细胞很难实现钳制；④该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大细胞中解脱出来，而向人类和哺乳类细胞发展。
5.5穿孔膜片记录技术（perforated patch recording technique）Hom和Marty于1988年首次建立了一种对传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），两性霉素B（Amphotericin B）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，将这类抗生素充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作穿孔膜片记录技术。
配制方法如下：首先在避光条件下配制二性霉素B的二甲基亚砜(DMSO)储备液。
用EP管称取适量二性霉素B，按照二性霉素B(mg)：DMSO(µL)=1:4的比例加入DMSO，在超声震荡器中加速溶解至其呈现澄清透明的橘黄色液体，然后置于－20οС冰箱中低温保存备用。
实验前用微量移液管吸取5µL二性霉素B的DMSO液加入到含5mL电极液的棕色小瓶内，适当吹打后经超声振荡助溶。
穿孔电极液中二性霉素B的终浓度为250µg/mL，其中DMSO的浓度为0.1%。
配制好的穿孔液转入用锡箔纸包裹的注射器后置于4οС冰箱中备用。
优点：与全细胞记录相比，该技术相比有如下优点①由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不能通过。
因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质仍可正常运行。
②因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子的浓度就不受电极液的影响。
因此可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离的Ca2+水平。
③对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，记录时间可持续3小时。
④高阻封接不易被破坏，而全细胞记录的负压脉动式抽吸和电压脉冲易致高阻封接破坏。