微小组织快速冰冻切片法
医院冰冻切片技术操作规程
冰冻切片技术操作规程
1.接通电源开关，打开箱内照明灯，设定或调整切片温度（-25℃左右）。
将切片刀装入持刀架上固定。
2.将待切样品以OCT包埋在持物托上置于切片机冷冻台冷冻，打开速冻开关。
待切片机箱内温度达到设定温度及样品冻硬后，将样品连同持物托一同置于持物架上，固定。
3.右手转动旋转轮，左手间断按动样品前进开关，使样品徐徐向前推进，直至组织平面完全修出平整。
4.调整好防卷板至刀刃平行，定好欲取切片的厚度标尺（6-10微米），放下防卷板，速度均匀的转动切片机旋转轮，切片。
5.打开防卷板，用玻片吸附切片，切片会自然附贴于玻片上。
以95%乙醇固定1-3分钟即可进行染色。
6.染色完毕后，将持物托上的剩余组织放入有编号的包埋盒内并固定。
将持物托用水洗涤干清、擦干备用。
7.将切片机中的碎组织彻底清理干净，用棉花蘸无水酒精轻轻擦拭防卷板及刀架。
8.关闭箱内照明灯，将切片机温度调至保持温度（-6℃）。
术中快速冰冻切片技术及应用
术中快速冰冻切片技术及应用
术中快速冰冻切片技术是一种在手术过程中对组织进行快速诊断的方法。
这种技术通常用于需要即时诊断的情况，例如判断肿瘤的性质（良性或恶性）或者确定手术切除的边缘是否清晰。
过程如下：
1. 取样: 在手术过程中，医生会选择一个代表性的组织样本。
2. 冷冻: 这个样本会被迅速冷冻，通常使用液氮或者特殊的冷冻剂。
3. 切片: 冷冻后的组织会被切成非常薄的切片，通常厚度在5-10微米之间。
4. 染色: 这些切片会被迅速染色，以便在显微镜下观察。
5. 诊断: 病理医生会在显微镜下观察这些切片，并给出初步诊断。
6. 反馈: 病理医生的诊断结果会迅速反馈给手术医生，以指导后续的手术步骤。
这个技术的优点是可以在短时间内得到诊断结果，有助于医生做出即时的决策。
但也有一些局限性，比如可能会有假阴性或假阳性的结果，或者在某些情况下，冰冻切片的质量不足以做出确切的诊断。
总的来说，术中快速冰冻切片技术是一个非常有用的工具，可以在手术过程中提供即时的诊断信息。
但是，它通常只被视为一个初步的诊断方法，最终的诊断还需要通过常规的病理检查来确认。
微小组织快速冰冻切片法
微小组织快速冰冻切片法自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。
随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。
为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。
1材料与方法1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。
②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。
③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。
④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。
1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。
②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。
③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。
使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。
④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。
⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。
冰冻切片步骤2010.6
1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
2．组织固定与切片：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
修片，切片。
重点步骤室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗，5分钟×3。
进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。
（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。
3．组织切片免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。
圈也不宜太大，太大则浪费抗体。
选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。
滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！Frozen section01什么是冰冻切片？冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
02制备步骤将组织在恒温冷冻切片机里切片。
冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
1）当冰冻组织取好后，在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻；2）待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上；3）粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片；4）放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为5～6微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇冰醋酸液（97ml甲醇+3ml冰醋酸）中固定，固定时间为10～20秒；03注意事项1）速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。
而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
2）固定：切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。
固定液有很多种，甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，而每97ml加入冰醋酸3ml，会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。
3）包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。
太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉，影响切片的质量。
4）冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板。
最好能使用一次性刀片。
5）如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
微小组织冰冻快速制片技术分析
微小组织冰冻快速制片技术分析【摘要】目的：试验分析微小组织冰冻快速制片技术。
方法：选取200例微小组织，针对其冰冻快速制片过程常常出现冰晶、染色不均、切片多粒组织不全等问题，建立普通对照组与3个相应实验组（n=50），分别采用普通处理对照组和预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理、速冷冻方法，进行冰冻快速制片，对比其制片问题发生几率。
结果：预冷冻平铺包埋处理切片多粒组织不全发生几率远低于普通处理；经过预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理出现冰晶问题大幅降低，后行速冷冻处理下，制片质量大幅提高。
结论：微小组织冰冻快速制片技术中，采取预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理、速冷冻处理相结合是提高其制片质量的关键手段。
【关键词】微小组织；冰冻快速制片病理的诊断过程中，随着各类疾病的治疗制作穿刺活检标本的需求量的增多，对于微小组织的冰冻快速制片技术运用越来越广泛[1]。
微小组织的快速制片过程由于纤维内镜、穿刺组织相对细小，且存在多黏液、多纤维成分的情况，常会出现制片问题冰晶、染色不均、切片多粒组织不全等，面对此类问题，为探究合理的解决方法，本研究选取300例微小组织开展相关对比试验，探究提高冰冻切片质量的有效方法，现报道如下[2]。
1一般材料与方法1.1一般资料本研究运用的200例微小组织来源自我院临床穿刺获得的活检标本，主要分为多粒新生组织和长条形组织[3]。
200例微小组织中，100例新生组织包括喉镜、胃肠镜、膀胱镜等穿刺标本，100例长条形组织包括肝穿、乳腺、肾穿等穿刺标本。
建立1个普通处理对照组和A.预冷冻平铺包埋、B.吸水纸处理、C.速冷冻方法3个阶段步骤实验组（只进行A步骤，进行A+B步骤、进行A+B+C三个步骤），每组各50例活检标本，其中包括多粒新生组织和长条形组织各25例。
研究一般资料不存在明显差异性（P>0.05），见表1。
表1 各组一般资料对比1.2仪器与试剂300例微小组织均采用冰冻切片机进行切片，机器工作前工作环境温度设置在-20°~-25°之间[4]。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
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微小组织快速冰冻切片法
自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。
随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。
为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。
1材料与方法
1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。
②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。
③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。
④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。
1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。
②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。
③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。
使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。
④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。
⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。
2结果
组织切片完整,可连续切片,HE染色组织结构清晰,色彩鲜艳,细胞核、细胞质对比明显。
3讨论
快速低温恒冷冰冻切片是手术中病理诊断的方法之一,具有较广泛的应用,在很大程度上决定了手术的方式和治疗方案的确定,因此质量较好的冰冻切片,对病理医生和临床医生都至关重要。
对于大块组织的冰冻切片基本不成问题,既可用一块组织多切,又可再次取材,然而,对于直径小于0.3 cm的微小组织来说,材料显得尤为珍贵,要作出正确的诊断,就必须要有一张高质量的冰冻切片。
笔者将原组织包埋托进行改进,使切片刀与组织包埋托的接触面缩小,这样便于观察组织,又不至于损伤刀口,修切时防止将组织切完,有利于切片。
冰冻切片的包埋剂大致有以下几种:OCT包埋剂、纯胶水、稀释胶水(普通办公用胶水2份,加1份蒸馏水混合)、水等。
目前比较常用的是OCT包埋剂,但价格昂贵,我们用甲基纤维素做包埋剂,甲基纤维素广泛用做增稠剂、医学胶粘剂和保护胶体等,由于在低温下极易固化,在固定和染色过程中即溶于水,对组织和细胞结构无影响,且价格低廉,经过20余年的应用,取得了满意的效果。
笔者认为,甲基纤维素包埋剂不仅可用于微小组织的冰冻包埋,而且适用于所有的组织的冰冻切片,完全可以替代其他包埋剂。
微小组织由于直径一般小于0.3 cm,在放置多块组织时,速度要快,使多块组织在同一平面上,且不互相重叠,修切时进刀要慢,防止将组织修完,防卷板要调节合适,切片刀和防卷板要保持清洁,当切片刀上有霜时,用有机玻璃片刮除,这样便于连续冰冻切片,有利于病理医生观察不同切面,利于病理诊断。
本文介绍的方法有以下几个特点:①冰冻切片迅速及时,整个过程仅需几分钟。
②将组织包埋托进行改进,不易损伤切片刀,不易将组织修完。
③切片质量好,染色鲜艳。
④用甲基纤维素代替OCT做包埋剂,节约大量经费。