冰冻切片技术原理
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
【技术原理】
组织经固定后，含有大量水分，使用乙醇从低浓度到高浓度将组织内的水分逐渐置换出来，以利于透明剂和石蜡的进入，这个过程称为脱水。
组织脱水后，必须经过一种既能与乙醇相结合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用使石蜡浸入组织，这种溶剂使组织呈现出不同程度的透明状态，这个过程称为透明。
组织经过脱水、透明后用石蜡作为支持剂浸入组织内，使组织变硬并将组织包裹在内，有利于切片，这个过程称为浸蜡。
浸蜡后的组织块用石蜡包成块，使组织达到一定的硬度和韧度有利于切片。
【实验流程】
案例展示
技术总结
【常见问题】
1、切片上卷或皱起
切片刀角度过大或过小，调整角度以5°为宜。
2、切片有空洞及破碎不齐
切片时慢一点，轻削组织。
3、切片有褶皱
切片时对准蜡块表面轻轻哈气。
【注意事项】
1、组织硬度较大，容易发生切片碎裂，需经软化或脱钙；
2、摊片时间过长，组织中心易开裂；
3、摊片时间过短，组织有褶皱，影响后续染色拍照；
4、特殊组织的切片，在后续染色过程中容易出现掉片的情况，比如皮肤、脑组织；
5、切片太厚，容易导致染色程度过深。
冷冻切片技术课件ppt
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
03
冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。
冷冻超薄切片原理和使用
冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片技术是一种为了研究更接近于生物生活状态结构和功能而发展起来的电镜样品制备技术。
它是把样品进行冷冻固定后，进行超薄切片，省去了经典超薄切片法的长时间的固定、脱水和也埋等处理。
样励在切片前后，不经过强烈的化学处理，约胞结构能得到很好的保存；尤其是可溶性成分小会被抽提，使得电镜图像更接近于生物的生活状态。
可用于细胞免疫化学、可溶性成分自显影、尤其在X射线微区成分分析等研究中。
冷冻超薄切片机操作：在超薄切片机上加上高压冷冻仪冷冻附件就可进行。
冷冻超薄切片的制备程序可为两类：1.无溶液制备法：包括取材、快速冷踪、冷冻替代、切片、干燥、染色或不染色、镜检等几个步骤。
主要用于可溶性物质的放射白显影和X射线微区分析。
2.固定样品制备法：包括取材、醛类阑定、样品包埋或不包埋、冷冻保护处IR、快速冷冻切片、染包及镜检等步骤。
适用于进行形态学、细胞化学和免疫细胞化学研究。
用户经培训后取得资格可自行使用超薄切片机，使用步骤如下：1）开机2）检查是否处于切片模式，检查顶光底光是否亮度正常；3）将包埋块放入适当夹头并用六角扳手旋紧，以固定包埋块；（然后将夹头安装在修快台进行修快）；4）将夹头放入机械臂，并用手旋好螺丝上紧夹头（不可用六角扳手）；5）将玻璃刀/钻石刀安装在刀台上，用手旋好螺丝以固定刀，并注意检查刀台是否固定于底座上；6）检查刀间隙角，调整刀台角，选择适当的夹头角度等；7）设定切片窗口（上下范围）；8）对刀；9）选择所用切片速度和厚度；10）在刀槽内注水，注意水面平整；11）切片、捞片；12）关机、清理切片机，拿走个人物品，保持切片台面整洁；13）登记使用记录。
一文带你了解冰冻切片_1
一文带你了解冰冻切片发布时间：2021-03-22T13:16:34.660Z 来源：《医师在线》2020年11月21期作者：宋体梅[导读] 一文带你了解冰冻切片宋体梅（蓬安县人民医院；四川蓬安637800）冰冻切片指的是采用切片机对冷冻状态下的组织进行直接切片，实际上是通过水作为包埋剂，冰冻组织至坚硬状态后切片。
在冰冻切片前，不采用化学药品处理或加热组织，以此大大缩短纸片时间。
同时该纸片法无需脱水透明和浸蜡等步骤，多用于脂肪、神经组织和部分组织化学的纸片，作为一种高效的切片方式在临床诊断中广泛应用。
一、术中为何要做冷冻切片？众所周知，手术病理诊断中通常会做快速冷冻切片，但是很多人不一定了解为什么要做冷冻切片，其他切片也可以代替冷冻切片吗？常标准石蜡切片是临床病理检查中最常用的方法。
通常的做法是将脏器切除，并进行一系列后续的技术处理，包括固定、脱水、石蜡浸渍、包埋、切片、染色。
正常切片过程至少需要24小时完成，检查医师用显微镜观察分析，做出病理诊断，前后约需要3天。
一些外科医生没有太多的等待时间，需要在手术过程中立即了解病变的性质，从而缩小手术范围，进行合理的处理，这需要手术中的医生进行病理诊断，因此需要活检诊断速度快、效率高，冷冻切片时间短，通常需要30分钟左右的时间来完成整个诊断过程，外科医生可根据病理诊断改进手术方式，避免多次二次麻醉和手术，大大降低了患者的重复费用。
二、如何开展冷冻切片？（一）取材应尽可能地在短时间内取得新鲜的材料，避免组织产生死后变化。
（二）速冻为了保护细胞内的酶活性，缩短切片标本的制备时间，通常需要在取样后冷冻组织块，降低组织温度，缩短冷却时间，避免冰晶的形成。
实验室冷冻切片最常用的方法为液氮冷冻切片法，具体操作方式为将软塑料帽或专用小盒放入组织中，如组织块过小，则加入COT浸泡包埋介质组织，准备小杯、液氮，将小盒放入小杯中，当小盒底部与液氮沸腾气化反应时，保持小盒原位避免浸入液氮中，但是10到20秒，组织就会迅速冻结成碎片。
第三节冰冻切片介绍
第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。
它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。
本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。
一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。
冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。
在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。
而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。
二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。
固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。
2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。
冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。
3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。
使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。
切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。
4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。
然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。
5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。
染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。
最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。
三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。
通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。
2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。
通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。
制作冰冻切片的体会
制作冰冻切片的体会无论是在组织胚胎学等医学基础课中，还是在临床检验工作中，冰冻切片都有着举足轻重的作用，冰冻切片被广泛的运用在科研、教学和临床诊断中。
所谓冰冻切片就是组织在低温状态下在很短的时间内变硬并进行切片。
在临床外科手术中常常需要进行快速病理诊断，而冰冻切片就是一个很好的方法。
标签：冰冻切片；制作；体会冰冻切片是一种在低温的条件下使组织快速冷冻到一定的硬度然后进行切片的方法。
其制作过程简单方便快捷，在手术中快速进行病理诊断从而为手术在中快速确定组织性质，对医生的手术方案具有指导意义。
冰冻切片的组织在送检前不需要进行处理，其组织没有发生变化，使得原来的生活形态得以保持，特别是在免疫组织化学染色中，组织中的糖、酶、抗原、脂类等成分由于没有受到干扰而存在，组织中的细胞抗原的免疫性也得到了保存，对于需要检测糖、酶、抗原、脂类的不会受到影响。
但是，冰冻切片的制作过程要比普通的蜡切片难度大、要求高，而且组织冰冻的程度不好把握，在切片的过程中组织较易破碎，很难切成符合要求的薄片，在染色的过程中很容易脱片，所有以上这些因素都会影响到切片的质量，从而影响到了检测结果。
对于如何能有效快速高质量的制作符合要求的冰冻切片一直使我们面对的问题。
1材料和方法1.1 材料：恒冷切片机，切片刀，固定液，胶水，实验用用的新鲜组织如肝、肾、脾、皮肤、食管、胃、淋巴结、心肌、脑、卵巢、小肠等组织。
1.2 方法：采用新鲜的实验用的新鲜组织，取一块大小为1.5cm×1.5cm×3cm 的新鲜实验用组织，去除组织中的脂肪组织，在取组织的时候要注意保持干燥以免引起组织细胞发生变性和变化，把组织放在低温液氮中快速冷冻放置于冰冻台上。
在切片机内快速冰冻2分钟之后待切。
如果组织的体积较大冰冻时间相应延长，如果所取组织体积较小则相应的缩短冰冻时间，切片刀的温度控制在零下25℃-零下30℃之间。
在开始切片之前要对切片刀和防卷板之间的角度进行调整以防切出来的组织薄片卷曲。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片技术原理
冰冻切片技术原理冰冻切片技术是生物学领域中常用的一种技术，用于获得活体组织的高分辨率、高质量的切片样品。
这种技术能够保留组织的细胞结构和功能状态，并且可以用于进一步的光学显微观察、免疫染色和分子生物学分析。
冰冻切片技术主要包括冰冻、固定和切割三个步骤。
首先，冰冻是冰冻切片技术的第一步。
样品通常是通过浸泡在液氮中或使用特殊冷冻剂使之迅速冷冻。
在快速冷冻的过程中，水分子会形成冰晶，冻结组织细胞内的各种分子和结构，并起到了一个固定的作用，以保留细胞结构的完整性。
其次，固定是冰冻切片技术的第二步。
固定可以用于进一步固定组织内的分子和结构，以增加样品的稳定性和可视性。
常用的固定剂有乙醛、戊醛和混合溶液等。
固定可以通过交联细胞中的蛋白质和核酸，以防止其在切割过程中的失去或变性。
最后，切割是冰冻切片技术的第三步。
切割一般使用切片机或显微镜下的微操纵器进行。
切割机通常可以根据需要调整切片的厚度，一般为几微米至几十微米。
在切割过程中，样品需要保持冷冻状态，以保持细胞结构的完整性。
切割的刀片也需要保持锋利和无尘，以避免样品受到污染或结构损坏。
冰冻切片技术的原理主要是基于快速冷冻和固定的原理。
在快速冷冻过程中，组织内的水分子迅速形成冰晶，使细胞和组织的分子结构被固定，以保持其形态和功能的完整性。
同时，固定剂的使用可以进一步固定组织内的分子和结构，增加样品的可视性和稳定性。
通过冰冻切片技术可以获得高分辨率、高质量的切片样品，并可在进一步的显微观察、免疫染色和分子生物学分析中使用。
冰冻切片技术的优点在于它能够保留细胞和组织的细微结构和功能状态。
相比于传统的石蜡包埋切片技术，冰冻切片技术更适用于需要保留细胞结构和功能的研究。
此外，冰冻切片技术还可以用于多种组织类型的切割，如生物样本、植物组织、动物组织等。
总之，冰冻切片技术通过快速冷冻和固定的原理，可以获得高分辨率、高质量的切片样品。
它保留了组织的细胞结构和功能状态，并可用于进一步的显微观察、免疫染色和分子生物学分析。
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• 3.入苏木精染色2min，水洗。 • 4.1%盐酸酒精分化数秒，水洗。（0.5%氢氧化铵水溶液 返蓝数秒，水洗） • 5.伊红染液20s-1min，水洗。 • 6.70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇逐级脱水。 • 7.无水乙醇脱水2次。 • 8.二甲苯透明两次。 • 9.中性树胶封固。
六、冷冻切片的标准及染色的注意事项
四、冷冻切片的制作方法
• 10.也可不使用放卷板，用毛笔轻带组织下方的白边（OCT），随机 器的慢慢转动，用毛笔轻轻从上至下展开组织，使其平坦，组织齐 全满意时，用毛笔轻轻压住切片的下方，右手拿载玻片轻 轻平稳地压组织，使其平整地吸附在载玻片上，迅速放入固 定液，进入染色程序。 • 11.正确地调整使用冷冻切片机的放卷板是获得平展完整 冷冻切片的重要手段，放卷板的正确位置是，与切片刀的 刀刃平行并略微突出于刀刃。
• 冷冻切片的重要环节是温度。
• 1.冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整 到适宜的切片温度，一般情况下为-25~-18℃。 • 2.在标本托上涂一层冷冻包埋剂OCT，然后将取材后的新 鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT包埋剂覆盖标本。 • 3.组织较小或较薄，可先将OCT滴加在标本托上，冻成一 个小冷台，将组织放在小冷台上，再覆盖OCT冷冻，并用 冷冻锤轻轻压平。 • 4.标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整 机头的位置使其恰好位于切片刀的后方。
冷冻切片制作技术
• • • • • • •
一、冷冻切片的意义 二、恒温冷冻切片机的结构与功能 三、冷冻切片组织的取材 四、冷冻切片的制作方法 五、冷冻切片的固定和染色 六、冷冻切片的标准及染色的注意事项 七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维 护
一、冷冻切片的意义
• 1.快速诊断：冷冻切片可称之为病理科的急诊工作，常 用于临床手术科室快速组织学诊断，特别是在手术进行当 中取出病变组织，要求病理医师在很短的时间内做出良、 恶性的正确的诊断，为临床医师下一步的手术方案及治疗 提供指导。 • 2.显示组织中脂质 脂肪染色和神经组织髓鞘的染色等 • 3.显示酶活性 主要应用于肌肉活检的检查 • 4.免疫荧光的研究
二、恒温冷冻切片机的结构与功能
• 1.结构：恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成，具 有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、负压等功能。 • 2.功能：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产 生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需 要脱水处理，因此制片速度快，是为术中提供快速病理诊 断的良好方法。 • LEICA CM1850
四、冷冻切片的制作方法
• 5.以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平 面，用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。 • 6.确认切片的厚度，一般6~10um不等，根据组织的不同 可适当调整切片的厚薄。 • 7.放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突 出刀刃。 • 8.以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷 板下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲可 用小毛笔轻轻展平。 • 9.打开放卷板，用载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸 附到载玻片上。
制作人：许艳华
三、冷冻切片组织的取材
• • • • • • • • 1.标本必须新鲜无固定，无液体浸泡； 2.组织块大小厚薄适宜； 3.组织块未受挤压； 4.尽量保持组织的原有形态； 5.选择好组织切面； 6.保持组织的清洁； 7.切除不需要的部分，遇有脂肪组织要剔除； 8.组织内有异物一定要清除。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
四、冷冻切片的制作方法
• 一、冷冻切片的标准
• • • • • • • • • • 1.操作正确 2.切片完整 3.厚薄均匀 4.无褶无刀痕 5.组织内无冰晶 6.核质分明，染色适度 7.组织结构清晰 8.脱水透明洁净 9.封裱美观 10.时间迅速
六、冷冻切片的标准及染色的注意事项
• 二、冷冻切片染色的注意事项
• 1.提倡使用新鲜苏木精染液，每天过滤，防止沉渣及结晶 的形成，保证高质量的冷冻切片以利诊断。 • 2.室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色 不佳，染色质不清晰，影响诊断。
七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维护
• 1.切片前，厚度应预先调制好，刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织 块使用。 • 3.切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。 • 4.每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑，以 防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必 须用毛笔清洁碎屑，以防其他组织碎屑沾染到正在进行切 片的标本上。
五、冷冻切片的固定和染色
• 一、冷冻切片的固定、固定液的选择
• • • • • • • 1.丙酮液 2.10%中性福尔马林缓冲液 3.95%酒精 4.乙醚、纯酒精等量混合固定液 5.AF液 6.AFA液 可根据工作要求选择适合于本单位的固定液
五、冷冻切片的固定和染色
• 二、冷冻切片染色
• 1.冷冻切片应立即放入固定液中。 • 2.固定1min左右，水洗。