冰冻切片及电镜标本的制备
冷冻电镜技术的原理和样品制备方法
冷冻电镜技术的原理和样品制备方法当我们谈论到电子显微镜（electron microscopy）时，多数人会想到传统的高分辨率电镜，然而冷冻电镜（cryo-electron microscopy）技术在近年来却引起了科学界的广泛兴趣。
冷冻电镜技术是一种能够观察生物大分子结构的重要技术手段，主要包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）两种主要形式。
本文将会介绍冷冻电镜技术的原理和样品制备方法。
冷冻电镜技术是一项复杂而独特的技术，广泛应用于病毒学、细胞生物学和生物物理学等领域。
其主要原理是将待观察的样品在低温下迅速冷冻，以减小样品中的弥散和聚集现象。
这样可以保持样品在接近生理环境下的原貌，更好地揭示生物分子的结构及其功能。
冷冻电镜技术具有高分辨率、无需染色和易于操作等特点，因此广泛应用于人们对生物体系的研究中。
样品制备是冷冻电镜技术的关键步骤之一。
样品制备的主要挑战是如何在保持样品原貌的同时使其适应电镜观察。
一般来说，样品的制备分为固态样品和溶液样品两种类型。
对于固态样品，首先要将待观察的样品制备成薄片。
这可以通过机械划片、离心切片或冷冻刀片切片等方法实现。
接下来的关键步骤是样品的冷冻。
为了避免样品的溶解和水分的蒸发，科学家们通常会采用高压冷冻法或液氮冷冻法。
高压冷冻法可以原位固化样品，减少水分蒸发；而液氮冷冻法则可以快速冷却样品，保持样品的自然结构。
冷冻后，样品可以通过薄片金箔浇筑、有机玻璃浇筑等方式加固，以提高其稳定性。
对于溶液样品，主要有两种常见的制备方法：投射和冷冻.为了制备冷冻样品，要将待观察的样品溶解在适当的缓冲液中，并通过超速离心来去除残留的颗粒物质。
然后，将样品放置在薄膜上，通常是铜格子膜或碳膜，并在低温下迅速冷冻以固化样品。
这种方法需要使用特殊的冷冻装置，如液氮盒，其可以通过控制温度和湿度，确保样品冷冻过程中的环境条件。
无论是固态样品还是溶液样品，接下来的步骤都是与电镜观察密切相关的。
冷冻电镜实验方法
冷冻电镜实验方法引言：冷冻电镜（Cryo-EM）是一种先进的显微镜技术，可以用于观察生物分子的高分辨率结构。
与传统的电镜技术相比，冷冻电镜在样品制备过程中避免了化学固化和染色等步骤，因此能够保持生物分子的原始状态，提供更真实的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜实验方法的基本步骤和关键技术。
一、样品制备1. 选择合适的样品：冷冻电镜适用于观察各种生物分子的结构，包括蛋白质、核酸、病毒等。
样品应具有较高的纯度和稳定性，以确保实验结果的准确性。
2. 冷冻固化：将样品溶液滴在金属网格上，然后迅速将其浸入液氮中，使样品迅速冷冻成无定形的冰层。
冷冻过程中，要尽量避免样品的晶化和结构变化。
3. 选择合适的冷冻介质：冷冻介质可以增强样品的稳定性并减少冷冻过程中的结构损伤。
常用的冷冻介质包括蔗糖、甘油等。
二、冷冻电镜图像获取1. 冷冻电镜仪器设置：调整冷冻电镜的操作参数，如加速电压、聚焦、对比度等，以获得清晰的图像。
2. 样品加载：将冷冻固化的样品网格安装到冷冻电镜仪器中，确保样品的位置准确，并避免震动和晶格偏移。
3. 图像获取：通过调整电子束的强度和聚焦，使电子束通过样品并与样品相互作用，产生散射。
通过捕捉和记录散射电子的位置和强度，得到样品的二维或三维图像。
4. 图像处理：对获得的图像进行去噪、对齐、投影重建等处理，以提高图像的质量和分辨率。
三、冷冻电镜实验注意事项1. 样品保持低温：在整个实验过程中，要保持样品的低温状态，以防止样品结构的热损伤和冰晶的熔化。
2. 避免辐射损伤：电子束的辐射可能会对样品产生破坏，因此在图像获取过程中要控制电子束的强度和曝光时间。
3. 样品纯度和稳定性：样品的纯度和稳定性对于获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。
应该避免样品中的杂质和聚集现象。
结论：冷冻电镜实验方法是一种强大的工具，可以帮助科学家们研究生物分子的结构和功能。
通过合理的样品制备和仪器调整，冷冻电镜可以提供高分辨率和真实的结构信息，为生物科学研究提供有力的支持。
冷冻超薄切片原理和使用
冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片技术是一种为了研究更接近于生物生活状态结构和功能而发展起来的电镜样品制备技术。
它是把样品进行冷冻固定后，进行超薄切片，省去了经典超薄切片法的长时间的固定、脱水和也埋等处理。
样励在切片前后，不经过强烈的化学处理，约胞结构能得到很好的保存；尤其是可溶性成分小会被抽提，使得电镜图像更接近于生物的生活状态。
可用于细胞免疫化学、可溶性成分自显影、尤其在X射线微区成分分析等研究中。
冷冻超薄切片机操作：在超薄切片机上加上高压冷冻仪冷冻附件就可进行。
冷冻超薄切片的制备程序可为两类：1.无溶液制备法：包括取材、快速冷踪、冷冻替代、切片、干燥、染色或不染色、镜检等几个步骤。
主要用于可溶性物质的放射白显影和X射线微区分析。
2.固定样品制备法：包括取材、醛类阑定、样品包埋或不包埋、冷冻保护处IR、快速冷冻切片、染包及镜检等步骤。
适用于进行形态学、细胞化学和免疫细胞化学研究。
用户经培训后取得资格可自行使用超薄切片机，使用步骤如下：1）开机2）检查是否处于切片模式，检查顶光底光是否亮度正常；3）将包埋块放入适当夹头并用六角扳手旋紧，以固定包埋块；（然后将夹头安装在修快台进行修快）；4）将夹头放入机械臂，并用手旋好螺丝上紧夹头（不可用六角扳手）；5）将玻璃刀/钻石刀安装在刀台上，用手旋好螺丝以固定刀，并注意检查刀台是否固定于底座上；6）检查刀间隙角，调整刀台角，选择适当的夹头角度等；7）设定切片窗口（上下范围）；8）对刀；9）选择所用切片速度和厚度；10）在刀槽内注水，注意水面平整；11）切片、捞片；12）关机、清理切片机，拿走个人物品，保持切片台面整洁；13）登记使用记录。
冷冻电子显微镜的使用技巧与样品制备方法
冷冻电子显微镜的使用技巧与样品制备方法冷冻电子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可以用来观察生物样品的微观结构。
它的使用技巧和样品制备方法在生物学研究中非常重要。
本文将介绍冷冻电子显微镜的使用技巧以及一些常用的样品制备方法。
一、冷冻电子显微镜的使用技巧1. 仔细准备样品：在使用冷冻电子显微镜之前，首先需要准备好样品。
样品的选择要根据研究的目的来确定。
对于生物样品，通常需要制备成薄片或网状结构，以便电子束能够穿过样品并获得最佳的分辨率。
同时，还需注意样品的稳定性，避免冷冻过程中的溶胀或冻伤等情况。
2. 配置合适的显微镜参数：冷冻电子显微镜使用过程中，合适的显微镜参数配置也是非常重要的。
例如，应根据样品的大小和形状选择合适的孔径和窗口尺寸；合理选择加速电压和电流等参数，以获得最佳的成像效果。
此外，还需合理调节对比度和亮度，以获得清晰的图片。
3. 样品的冷冻和传输：冷冻是冷冻电子显微镜技术的关键步骤。
在冷冻过程中，样品应迅速冷冻，并保持低温以防止溶胀。
冷冻过程可以使用液氮或液氮混合物进行。
在将样品加载到冷冻电子显微镜中之前，还需要将样品传输到适用的载玻片上，以确保样品的稳定性。
4. 图像的拍摄和分析：在使用冷冻电子显微镜进行拍摄时，需要注意减少图像模糊和伪迹的产生。
可以通过调整对焦、快速曝光和合理选择显微镜参数等措施来优化图像质量。
对于采集的图像，可以使用图像处理软件进行后期处理和分析，以提取有关样品结构和特征的信息。
二、样品制备方法1. 冷冻固化法：冷冻固化法是一种常用的样品制备方法，适用于研究细胞和组织的结构。
首先，将样品固定在液氮或液氮混合物中，然后迅速冷冻以保持样品的原始结构。
冷冻后，可以通过切片或断面技术来观察样品的微观结构。
2. 冷刀法：冷刀法适用于制备大分子复合物等较大的样品。
在这种方法中，样品首先通过冷冻固化法获得，然后使用冷冻刀片切割成较小的块。
切割后的样品块可以通过冷冻切片技术获得较薄的样品切片，以便于冷冻电子显微镜的观察。
电镜切片样品制作步骤
电镜切片样品制作步骤1.样品固定：首先需要选择适当的固定剂将待观察的样品固定在其中一种状态下。
常用的固定剂有冷冻醇、甲醛、醋酸乙烯等。
固定剂的选择需根据待观察的样品性质和研究目的进行确定。
2.洗涤：固定后的样品需要进行洗涤以去除固定剂和不需要的杂质。
常见的洗涤液包括磷酸盐缓冲液(PBS)和磷酸盐缓冲液。
洗涤的步骤和次数根据样品和实验要求可以有所不同。
3.电镜样品预备：电镜切片样品制作需要将洗涤后的样品处理成合适的状态。
通常情况下，样品需要进行脱水和浸渍。
脱水是将样品逐渐从水中转移到乙醇或丙酮中，以保持样品在固定状态。
浸渍是将样品浸入浸渍剂，使得样品透明并易于切片。
4.树脂包埋：将经过脱水和浸渍的样品置于树脂中浸泡，待树脂浸透后，进行树脂包埋。
这一步骤的目的是使样品更加稳定，并得到均匀的切片。
5.切片：经过树脂包埋后，使用超薄切片机进行切片。
切片机通常配备钻石刀，可以切割出纳米尺度的切片。
切片过程需要控制多个参数，如切片角度、速度、厚度等，以获取最佳的切片切面。
6.切片品质检查：将切片放置在显微镜下观察，检查切片的品质。
如果切片有较多的损伤、断裂或不透明的区域，可以重新进行切片。
7.网格染色：切片制备完成后，进行网格染色以提高对比度和观察的清晰度。
常用的网格染色方法有使用庞氏染色剂或重金属染色剂。
8.显影：将染色后的切片放入显影剂中进行显影，增强对比度和细节。
9.气相金属喷镀：一些样品需要进行气相金属喷镀以提高导电性。
将样品放入金属喷镀仪器中，通过高温蒸发金属薄膜，在样品表面形成导电薄膜。
10.观察和记录：将制备好的切片放置在电镜台上，使用透射电子显微镜进行观察。
在观察的同时，及时记录所见到的现象和数据。
综上所述，电镜切片样品制作是一个复杂的过程，需要经过固定、洗涤、预备、包埋、切片、染色、显影、喷镀等多个步骤。
每个步骤都需要合适的条件和操作技巧，才能得到理想的样品，为电镜观察提供准确、可靠的数据基础。
冷冻电镜流程
冷冻电镜流程一、引言冷冻电镜（Cryo-EM）是一种用于观察生物分子结构的先进技术。
与传统的电子显微镜相比，冷冻电镜能够在冷冻状态下直接观察生物样品，避免了生物样品在制备过程中的伪装和变性，从而提供了更真实、更准确的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜的基本流程。
二、冷冻电镜流程1. 样品制备冷冻电镜的样品制备是整个流程中非常关键的一步。
首先，需要选择适合冷冻电镜观察的样品，如蛋白质、细胞或病毒等。
然后，将样品制备成纯净的溶液或悬浮液。
接下来，将样品滴在特制的网格上，并通过吸附或冷冻的方式将样品固定在网格上。
2. 冷冻冷冻是冷冻电镜中非常重要的一步，它能够保持样品的原始结构。
冷冻的主要目的是使样品迅速冷却到液氮温度，避免样品在冷冻过程中发生结构变化。
通常，可以使用液氮冷冻样品，或者将样品暴露在液氮中的乙烷中进行冷冻。
3. 电子显微镜扫描在冷冻样品制备完成后，需要将样品放入电子显微镜中进行扫描。
在电子显微镜中，样品受到电子束的照射，并通过透射电子显微镜模式观察样品的结构。
通过调整电子束的条件和样品的位置，可以获取不同角度和不同焦距下的图像。
4. 图像处理获得的电子显微镜图像通常是模糊且包含噪声的。
因此，需要对图像进行处理，以获得更清晰、更准确的结构信息。
图像处理的主要步骤包括去噪、增强对比度、对齐和三维重建等。
通过这些处理步骤，可以获得高分辨率的三维结构模型。
5. 结果分析需要对获得的结构模型进行分析和解释。
可以使用分子建模软件将蛋白质或其他生物分子的原子坐标与结构模型进行比较，以验证模型的准确性。
此外，还可以使用其他生物物理学和生物化学技术对结构进行进一步的验证和研究。
三、总结冷冻电镜流程是一系列严格的步骤，其中每个步骤都非常关键。
样品制备、冷冻、电子显微镜扫描、图像处理和结果分析都需要仔细操作和科学实验设计。
通过冷冻电镜，我们可以获得高分辨率的生物分子结构信息，为生物科学研究提供了强有力的工具。
未来，冷冻电镜技术的发展将进一步推动生物科学的进步和发展。
冷冻电镜制样流程
冷冻电镜制样流程冷冻电镜（cryo-electron microscopy）是一种用于观察生物分子的高分辨率电镜技术，它可以在冷冻的状态下直接观察生物分子的结构。
相比传统的电镜技术，冷冻电镜能够提供更高的分辨率和更真实的结构信息，因此在生物科学研究中得到了广泛的应用。
1.选择适当的样品：首先，要选择适合进行冷冻电镜观察的样品，通常是蛋白质、蛋白质复合物、病毒或细胞等生物分子。
样品应具有较高的纯度和稳定性，并且能够在低温条件下适当冻结。
2.制备冷冻电镜网格：使用特殊的电子显微镜网格制备样品载体，通常是由碳或氧化硅等材料制成。
这些网格是非常薄的，样品可以被直接放置在其表面。
3.调整制样参数：根据样品的特性和所需要的分辨率，调整各种制样参数。
这些参数包括冷冻速率、冻结液的成分和温度等。
冷冻速率是制样的关键参数之一，它能影响样品的冷冻效果和结构质量。
4.加载样品：将样品溶液滴在电镜网格上，然后迅速从反面用纸吸干多余的液体。
样品的浓度应适当，以避免结构中的过度吸收或散射。
5.冷冻样品：将已加载的样品网格迅速放置在冷冻压制机中，通过控制温度和压力来冷冻样品。
冷冻的目的是快速冻结样品，以保持其原始结构。
6.保存和传输样品：冷冻后的样品应立即封存，通常使用液氮来保存。
在传输或搬运时，需要采取适当的保护措施，确保样品不受到损坏。
7.电镜观察：将冷冻的样品网格放置在冷冻电镜中，然后使用高分辨率电子束来观察样品的结构。
观察过程中需要避免样品的加热和辐射。
8.取得图像和数据处理：通过电子镜的成像系统获得样品图像，然后使用图像处理软件对图像进行修正和重建。
这些步骤包括噪声过滤、对齐和三维重构等。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
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冰冻切片的制备
一、冰冻切片技术的概述
（一）优点：
1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。
2．快速，用时短。
3．组织变化不大。
4．能很好保存脂肪，类脂等成分。
5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
（二）缺点：
1．不容易做连续切片。
2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。
3．不容易制作较薄的切片。
4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（三）主要应用于：
1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
3．用于临床手术的快速病理诊断。
二、冰冻切片机的使用及注意事项
（1）新鲜的组织制备
组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
（2）固定组织的制备
为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
（3）恒冷箱温度
一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。
每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度
肝-18 -10 -5
肾-15 -8 -5
皮肤-35 -10 -5
脑-18 -5 -5
固定组织一般高3-5度
（4）抗卷板
抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。
抗卷板略高于刀面的最高点。
可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜
（5）切片机
操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。
即可切片。
恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。
（6）切片刀新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。
如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。
三、冰冻干燥
原理
为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。
过程
小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后，升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。
特点
能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。
但仪器贵，需时长。
四、冰冻替代法
原理
低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。
过程
组织块骤冷→组织内的水，在低温（－40℃～－70℃）液体脱水剂中被替代（醇、丙酮），同时起到固定作用→脱水组织渐恢复到室温，用石蜡包埋。
特点
①新鲜组织在24小时内制成切片
②可保存较多的酶活性
③经济、简单且有重复性，但对细胞器保存不佳，不能用于电镜
电镜标本的制备
一、概述
20世纪30年代（1935年）在德国发明并生产了第一批电子显微镜以来，应用日渐广泛，使组织学的研究上了一个新的台阶，开避了新纪元，从一般显微结构领域迈入了亚显微结构水平。
（一）透射电镜（transmission electron microscope，TEM）：是最广泛使用的一类电镜。
它的特点是电子束必须穿透样品，因此观察的样品必须很薄，约为50nm左右。
可观察细胞和组织的超薄切片，复型膜，负染样品等。
（二）扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）：主要特点是观察物体表面的立体微细结构。
其在医学上主要用于观察组织或细胞的表面或断面结构，扫描图像具有立体感，样品制备较简单，因此在医学上应用日渐增多。
二、标本的制备
（一）取材
1．原则：
快、准、轻、小、冷；1mm3
2．注意事项：
（1）防止组织挤压和过度伸展；
（2）使用锋利的刀，尽量减少对组织的机械性损伤；
（3）取材最好在冰块上，或同时放在固定液内操作；
（4）培养细胞的收集时，要将培养液离心后，取沉淀物漂洗固定。
（二）固定
1．常用固定操作的方法
（1）戊二醛-锇酸双重固定法
前固定：2%戊二醛
后固定：1%锇酸
（2）培养细胞固定法
培养细胞需要固定时，先弃去培养液，加入戊二醛固定液，在冰溶或4℃的温度下放置5~10分钟，再用刮板将细胞刮下，倒入离心管中离心弃上清，沿管壁缓缓加入预冷的戊二醛固定液15 ~30分钟，再吸去上清，经缓冲液清洗15分钟后，继用1%锇酸对样品作后固定30分钟。
2．注意事项
（1）理想的固定剂应能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞杀死尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形。
（2）固定液的酸碱度必须与被固定组织的酸碱度基本一致，大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4。
（3）缓冲液的选择要根据实验不同要求加以选择；磷酸盐缓冲液可以有效地控制固定液的酸碱度，并能促进样与铅盐、铀盐之间的反应，是动物组织的有效缓冲系统，但缺点是可抑制细胞内某些酶（如6磷酸葡萄糖脱氢酶）的反应。
（4）戊二醛固定后必须充分浸洗，才能转入锇酸固定。
（5）戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸钠缓冲液配制，不能用醋酸—巴比妥缓冲液，因此缓冲液可使戊二醛的醛基失效。
（三）脱水
1．脱水过程
脱水剂：乙醇或丙酮
彻底清洗样品
50%乙醇或丙酮10~15分钟
70%乙醇或丙酮10~15分钟
80%乙醇或丙酮10~15分钟
90%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮30分钟
2．注意事项：
（1）脱水要彻底；
（2）如果当天完不成浸透、包埋操作时，应将样品停留在4℃70%乙醇或丙酮中过夜。
（3）脱水操作动作尽量要快，特别是100%脱水剂，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥。
（四）浸透和包埋
1．浸透包埋剂：Epon812环氧树脂包埋剂
A液：Epon812 10ml
DDSA十二烷基琥珀酸酐16ml
B液：Epon812 10ml
MNA六甲酸酐8.9ml
A液和B液按比例混合，B液比例越大，包埋块越硬（冬天1：4；夏天1：9），待上述二液混匀后再按1.5~2%的体积比，在充分搅拌中滴加DNP-30
2．过程
（1）脱水后的样品入丙酮、环氧丙烷等量混合液15min
（2）环氧丙烷Ⅰ15min
（3）环氧丙烷Ⅱ15min
（4）环氧丙烷、包埋剂等量混合液数小时
（5）纯包埋剂数小时
3．包埋
（1）定向包埋
（2）烘干包埋板
（3）37ºC ~45ºC恒温箱中24小时
（4）60ºC恒温箱24小时
（5）72ºC恒温箱24小时
4．注意事项
（1）浸透、包埋用注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签及其它器皿，均应在用前烘干，有能有任何水分。
（2）所用的药品均应注意防潮，药品应在干燥器中存放或在冰箱里保存。
（3）包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。
（4）操作时皮肤勿接触包埋剂，以防引起皮炎。
（5）制好的包埋块应放于带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。
（五）半薄切片
包埋块的修整
切片刀的制备：玻璃刀，钻石刀
定位
（六）超薄切片
选择与清洗载网
制备支持膜
切片
捞片
（七）电子染色
1．电子染色剂
（1）醋酸铀：浓度为饱和液
醋酸铀2g
50~70%乙醇100ml
PH4.2
（2）铅盐类
硝酸铅Pb(NO3)2 1.33g
柠檬酸钠Na(C6H5O7)·2H2O 1.76g
蒸馏水30ml
将上试剂放入50ml容量瓶内，用力振荡30分钟，发生化学反应，结合为柠檬酸铅，溶液呈现为乳白色的柠檬酸铅混悬液，然后加入1N氢氧化钠8ml，使柠檬酸铅溶解，变成无色透明状，
最后再加蒸馏水至50ml，PH为12 2．过程：
（1）醋酸铀滴注染色30分钟（2）清洗3次
（3）柠檬酸铅滴注染色30分钟（4）自然干燥即可电镜观察。