分子生物学实验2

PCR反应中的成份
1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所 决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物 与模板配对，从而使非特异性增高。太长浪费。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引 物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3‘端避免连续3个G或C,因这样 易导致错误引发。 (4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二
Determine your Mg2+ Concentration
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 mM
通常1～1.5mM MgCl2 是最佳选择，Mg2+ 的 浓度受DNA的量、引物的量的影响，同时 所扩增DNA的量受Mg2+ 的浓度的影响。
4. 模板： PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是 单链分子，也可以是双链分子，可以是线状也可以是环 状分子。模板影响PCR的主要因素是数量和纯度。一般 对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng 的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时 ，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。 DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的 DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时 间。
3. 将加好的管充分后，离心数秒，放入PCR仪上。 4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪。 电泳 PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行 电泳分析，检查反应产物及长度。
电泳结果如图所示
[注意] 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要 互相污染试剂。 3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手 套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
【实验器材】 PCR仪，台式离心机，微量移液器（20μ l, 200 μ l 1000 μ l ）,0.2 μ l Enpendorf管，电泳设 备等 【实验材料】 pADH的PMD-20T质粒的模板，引物，4dNTP mix，Taq酶，PCR缓冲液、无菌水，琼脂糖， DNA染料，电泳缓冲液等。 【实验内容】 1. PCR基础知识介绍； 2. PCR的基本原理； 3. PCR引物设计原则； 4. PCR的基本过程及程序设计；
3’
-OH
OH3’
2. 四种三磷酸脱氧核苷酸(4XdNTP) dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测 定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装 ,-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中 合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L 时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度 应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现 的错误掺入。
分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验二 PCR扩增目的基因
授课教师：田生礼
实验二 PCR扩增目的基因
【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了 解PCR产物的保存方法；
变性 Denaturation 94~95℃，1min
复性 Annealing ~55℃,1min
延伸 Extension 70~72℃,1min
72 ℃ 延伸10min DNA扩增100万倍
【操作步骤】 1. 建立PCR反应体系（依次混匀下列试剂）
组成成分 加入量（μl）
DNA模板(质粒)
引物PPA 引物PPD
PCRBiblioteka Typically in the range of 100-300 bp long.
PCR扩增
PCR特点及应用
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物 ;
缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
PCR应用
• • • • • • • 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents • 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases • 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA • 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations
3. Mg2+： Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的 活性和真实性，影响引物退火和解链温度, 影响产物的 特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围 为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少有 高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可 能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度 。
【实验原理】
1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷 酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性、退火和延伸，3个步骤作为PCR的一个循环，每当完 成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指 数形式增长。
灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。 (3) 99-100℃加热10min. (4)目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6. 反应缓冲液：
反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris· (20℃下 Cl pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl 和 适 当 浓 度 的 Mg2+ 。 Tris· Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中， pH为6.8-7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT) 或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶 活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长 的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自 己特定的一些缓冲液。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 • 体外程序化的DNA合成技术。
devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
位核苷酸对应,以减少因密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3‘端应不存在二级结构。 (6) 两引物之间尤其在3‘端不能互补, 以防出现引物二 聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同 源性或互补性。 (7) 引物5‘端可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体 结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记 生物素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1-2 个保护碱基。 (8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产 物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响 产量。
1
0.5 0.5
4XdNTP Mix
10XPCR缓冲液 Taq 酶
4
5 0.5
H 2O
总体积
38.5
50
2. 设定PCR循环参数：
Temperature 94 ℃ 94 ℃ 55 ℃ 72 ℃ 72 ℃
Time 5 min 30 sec 30 sec 1min20sec 8 min
Cycles 1 30 1
思考题 1.降低退火温度对反应有何影响？ 2.延长变性时间对反应有何影响？ 3.循环次数是否越多越好？为何？ 4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？
对PCR的优化是必需的！！！
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