免疫血清学技术
免疫学课件——第七章 血清学反应
免疫学原理与技术
5.血清学反应的影响因素 电解质:抗原与抗体的反应需要在适当浓 度的电解质参与下,才出现可见反应.血清学反 应一般用生理盐水作稀释液,但禽类血清需用 8-10%的高渗氯化钠溶液. 温度:通常用370C水浴中,有的补体结合反 应在冰箱低温结合效果更好. pH:血清学反应常用的pH为6-8,过高或过 低的pH可使抗原抗体复合物重新解离.如pH 降至抗原或抗体的等电点时,可引起非特异性 的酸凝集,造成假象.
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2.结合力和离解力 抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结 合,是分子表面的结合,这一过程受物理化学,热 力学的法则所制约,结合的温度应在0-400C范 围内,pH在4-9范围内,如温度超过600C或pH降 到3以下时,则抗原抗体复合物又可重新解离. 3.抗原抗体的结合比例 抗原与抗体的结合常需要适当的比例才出 现可见的反应,在最适比例时,反应最明显. 带现象:如抗原过多或抗体过多,则抗原抗 体的结合不能形成大的复合物,抑制可见反应 的出现. “格子学说”
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三.血清学反应的应用 1.抗原或抗体的快速检测 2.生物活性物质的超微量测定 3.抗原或抗体在细胞和亚细胞水平的定位 4.抗原组成的分析 5.微生物鉴定和抗原分型 6.血型鉴定
免疫学原理与技术
四.血清学试验的发展趋向 技术上要求高特异性,高敏感性,高分辨率, 精密定位,简易快速;在方法上要求微量化,自动 化,标准化;试剂上要求商品化.
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二.血清学反应的一般特点 1.特异性和交叉性 如肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌 Ab1 Ag1
Ab2 Ag2 交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据 关系数R R=√r1 *r2 x 100%
免疫学原理与技术
免疫血清学技术
直接凝集试验： 玻片法：鸡白痢玻片凝集 试管法：布氏杆菌试管凝集 间接凝集试验：
间接血凝试验：猪瘟间接血凝试验
乳胶凝集试验：猪伪狂犬病乳胶凝集试验 协同凝集试验：
SPA +
Ab
SPA-Ab +
Ag
SPA-Ab-Ag
2. 沉淀试验：
可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质 存 在情况下，产生可见的沉淀物。
补体结合反应的基本原理
Ag + Ab
Ag Ab +
C
Ag Ab C
Ag?
Ab
Ag+ Ab
C C
E E H
+ 不溶血
H
Ag-
Ab
Ag-
Ab 溶血
C
C
E H
E
H
五、
中和试验
抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去
毒力，接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。
1. 终点法中和试验（End-point neutralizing test）:
Reed 法Muench 计算半数致死量（LD50）。
2. 空班减少试验 ( Plague reduction test)：
应用空斑技术使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。
将已知空斑单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含 100 PFU，加等量递进稀释的血清，37 ℃ 1h 。接种细胞后， 覆盖琼脂，培养数天后，计算空斑数，计算血清的中和滴度。
（3）免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。
包括：免疫电泳
对流免疫电泳 火箭电泳
+
Ag Ab
Ag
Ab
血清免疫学
血清免疫学
血清免疫学是研究免疫学中的一种生理功能的检测，主要是借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对免疫分子（抗原、抗体、补体、细胞因子等）和免疫细胞进行定性、定量检测。
它包括检测血清中免疫球蛋白、心肌肌钙蛋白、肌红蛋白等指标，用于疾病的诊断、病情检测和疗效评价等。
血清免疫学检查是一种重要的临床检查项目，可以帮助医生了解患者的免疫状态和诊断疾病。
例如，检测免疫球蛋白可以帮助医生判断是否存在免疫缺陷或自身免疫性疾病；检测心肌肌钙蛋白和肌红蛋白可以帮助诊断心肌梗死等疾病。
在血清免疫学检查中，需要注意保持血清的新鲜和避免受污染，以保证检查结果的准确性。
同时，根据不同的情况，医生可能会要求进行特定的血清免疫学检查项目，以便更好地了解患者的病情和制定治疗方案。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅相关文献或咨询专业医生。
微生物的免疫技术—微生物的血清学技术
沉淀反应——可溶性抗原与相应 抗体结合所发生的沉淀反应 沉淀反应是指可溶性抗原（细菌 培养滤液、细胞或组织的浸出液、 血清蛋白等）与相应抗体在液相 中特异结合后，形成的免疫复合 物受电解质影响出现的沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原 （precipitinogen），可以是类 脂、多糖或蛋白质等；抗体称为 沉淀素（precipitin）。
不被结合而游离存在。 此时如在上述反应系统中加入绵羊红细胞(Ag)和溶血素(Ab)系统，即可与游离的补体结合而出现溶
血现象。因此，根据溶血现象是否产生，即可得知检测系统中有无相应的抗原或抗体存在。
3、补体结合反应(complement fixation reaction)
补体结合试验：（CFT） 抗原、抗体、 补体、红血球悬液、溶血素
凝集试验 ： 直接凝集试验、间接凝集试验、 乳胶凝集试验
补体参与的试验： 补体结合试验
沉淀试验： 环状沉淀试验、絮状沉淀试验、 琼脂扩散试验、免疫电泳
中和试验： 病毒中和试验
1、凝集反应 (agglutination)
凝集反应——颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应 细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量 电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称 为凝集反应。 反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen） 抗体称为凝集素（agglutinin）。 根据凝集反应的原理，以后又发展建立了各种直接凝集试验、间 接凝集抑制试验以及固相免疫吸附血凝试验等新方法。
2、电解质： 生理盐水做稀释液
3、温度：
37-45摄氏度
4、酸碱度 ： pH6-8
思考与讨论、任务
思考与讨论：我学到什么？
1、血清学反应的类型 2、血清学反应的特点 3、血清学反应的主要影响因素
免疫学课件：免疫血清学技术
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。
动物免疫抗体血清学检测技术
一、血清学检测的意义
动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动 物进行有效的免疫接种后，才能产生一定的保护力，从而防止疫 病的侵入和蔓延。因此在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测， 准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握畜禽免疫抗体水 平和动物疫病保护情况， 从而更有效地采取综合防控措施。因此， 做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。
4.第二次离心结束后，同样吸出上层液体及白细胞层，再加入适量 PBS缓冲液，配平后进行第三次离心，2000r/min离心10min，进一步 清洗红细胞。
5.离心结束，最后一次吸出上层清液。量取 99mlPBS缓冲液加入100ml大青瓶（或其他容 器），用注射器（或其他，如吸管）吸取1ml洗 净的红细胞，缓慢加入99mlPBS缓冲液中，塞紧 瓶塞。
材料准备 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味 虎红平板凝集反应纸 吸头，适用于滴加0.03ml 牙签或火柴杆，供搅拌用
操作方法 将虎红平板纸上加相应血清 0.03ml 。 在受检血清旁滴加抗原 0.03ml 。 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。 每次试验应设阴、阳性血清对照。
血凝素（HA） 柱状
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验：
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或 其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑 制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。 目的：检测有无病毒感染和免疫状态。
检验科常见免疫血清学检测方法与解读
检验科常见免疫血清学检测方法与解读【检验科常见免疫血清学检测方法与解读】免疫血清学检测是一种通过检测血液中的抗体和抗原来诊断疾病的方法，广泛应用于临床实践中。
本文将针对检验科常见的免疫血清学检测方法进行介绍，并解读其结果。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最为广泛的免疫血清学检测方法之一。
ELISA通过将待检测的抗体或抗原与酶标记的二抗结合，通过酶的催化作用得到显色反应来分析样本中的抗体或抗原含量。
在进行ELISA检测时，首先需要将样本与特异性抗体或抗原进行反应，随后进行多个洗涤步骤来去除非特异性结合的物质。
然后，加入酶标记的二抗与待测样本中的特异性抗原或抗体进行结合。
最后，加入底物，通过酶的催化作用使底物发生显色反应。
二、免疫荧光分析（IFA）免疫荧光分析（ImmunoFluorescence Assay，IFA）是一种通过使用荧光标记的抗体或抗原来检测目标物质的方法。
根据检测物质的不同，可以分为直接免疫荧光分析和间接免疫荧光分析。
直接免疫荧光分析是将荧光标记的抗体直接与待检测样本中的抗原发生特异性结合，然后使用荧光显微镜观察是否有荧光信号产生。
而间接免疫荧光分析则是先使用未标记的特异性抗体与待测样本中的抗原结合，随后再加入荧光标记的二抗与第一抗体发生结合，从而观察是否有荧光信号产生。
三、免疫印迹分析（Western Blot）免疫印迹分析（Western Blot）是一种用于检测抗体和抗原之间的特异性结合的方法。
在进行免疫印迹分析时，首先将待检测样本中的蛋白质经过电泳分离，然后转移到膜上。
随后，将荧光标记的抗体与待测样本中的抗原进行特异性结合，通过荧光显影或其他检测方法观察是否有特异性的蛋白带出现，从而判断抗体和抗原的结合情况。
四、血凝试验（Coagulation Test）血凝试验是一种通过检测血液中凝血因子的活性来评估凝血功能的方法。
免疫血清学检验
免疫血清学检验一、血清C-反应蛋白检验1．英文或缩写：C-Reactive Protein，C-RP。
2．标本采集：空腹静脉血2.0ml，立即送检。
应避免脂血、溶血和污染。
3．正常参考值：0-8g/L。
4．临床意义：CRP 是一种能与肺炎链球菌C 多糖体反应的急性时相反应蛋白，能激活补体，促进吞噬和其他免疫调控作用。
CRP 是一种急性期蛋白，在各种急性和慢性感染、组织损伤、恶性肿瘤、心肌梗塞、手术创伤、放射线损伤数小时迅速升高，病情好转时又迅速降至正常。
此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗影响。
细菌感染较病毒感染含量高，急性风湿病较慢性高。
5．注意事项：RF 可干扰本试验，产生假阳性结果，故类风湿关节炎患者欲用本试验判断其疾病是否活动，应先对其血清样品进行处理，以破坏RF，方法为：取待测血清125ul，加3mmol/L 二硫苏糖醇100ul，37ºC30 分钟后加0.25%H2O2(新鲜配置)150ul，再按操作。
(3mmol/L 二硫苏糖醇4ºC 可保存1 周)。
血清样品要用蒸馏水稀释，不可用生理盐水稀释。
胶乳试剂不可冻存，应保存于2-8ºC，用前摇匀；室温如低于20ºC，加胶乳试剂后应延长摇动时间2 分钟。
二、血清转铁蛋白检验1．英文或缩写：Transferrin，TRF。
2．标本采集：空腹静脉血2.0ml。
应避免脂血、溶血和污染。
3．正常参考值：(2.72±0.81)g/L。
4．临床意义：TRF 为β球蛋白中能和铁结合的一种糖蛋白。
利用转铁蛋白换算血清总结合力，比生化检验血清铁结合力方法简单、灵敏而准确，是诊断贫血的重要指标之一。
主要功能是运转微量元素铁，调节铁的吸收，防止机体吸收过多的铁，引起铁中毒。
升高：妊娠末期、缺铁性贫血、急性肝炎。
降低：急慢性感染、慢性肝炎、肝硬化、恶性肿瘤。
5．注意事项：及时送检，若不能及时送检，分离血清-20ºC 保存。
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荧光色素
是能够产生明显荧光，并能作为染料使用 的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。
可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基 异硫氰酸罗丹明(TRITC)
染色原理及方法
FITC含有异硫氰基，能与IgG分子自由基 结合，形成FITC-IgG复合物，且不影响结 合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗 体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体 复合物
高敏感性的标记分子
荧光素 酶分子 放射性同位素
荧光抗体技术 酶标抗体技术 同位素标记技术
（一）荧光抗体标记技术
fluorescent-labelled antibody technique
是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然 后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析 示踪相应的抗原或抗体的方法。
抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分 子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结 合的总面积大，故在作定量试验时，为了不 使过剩，通常稀释抗原，并以抗原稀释度作 为沉淀试验效价。
参加沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉 淀素。
环状沉淀试验
在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁 加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层
SPA与IgG结合后，其Fab片暴露于外，并保持其抗体 活性。
当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合 时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称COAG。
（二）沉淀试验
可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌 体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组 织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解 质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称 为沉淀试验(precipitation test)。
用于标记的酶
用于标记的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶
间接凝集试验
将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫 无关的，一定大小的不溶性颗粒(统称为载 体颗粒)的表面，然后与相应抗体(或抗原)作 用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现 的特异性凝集反应称为间接凝集反应。
敏感性高，但特异性较差
可溶性抗原
细菌、立克次氏体及病毒的可溶性抗原 原虫、吸虫、丝虫的浸出液 动物的可溶性物质 激素及各种组织器官浸出液 植物性蛋白质如花粉浸出液等 某些细菌的可溶性多糖
免疫电泳技术
免疫电泳 对流免疫电泳 火小，在含量低时形成的抗原 抗体复合物是不可见的。
将特殊物质标记在抗体分子上，通过检测标 记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根 据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感 性建立的技术，称为标记抗体技术(labelled antibody technique)。
对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。 利用聚苯乙烯乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原(或
抗体)，即能用以检测相应的抗体(或抗原)，称为乳胶 凝集反应。(latex agglutination test)
协同凝集试验
葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A，简称SPA) 是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多 种哺乳动物IgG分子的Fc片结合。
分为直接凝集试验（简称凝集试验）和间 接凝集试验。
直接凝集试验
颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集 现象的试验称作直接凝集试验(direct agglutination test)
玻片法：定性试验，适用于新分离细菌的 鉴定或分型
试管法：定量试验，检测待测血清中是否 存在相应抗体和测定抗体含量
常用的载体颗粒
有红细胞(“O”型人红细胞，羊红 细胞)、聚苯乙烯胶乳颗粒，
白陶土、离子交换树脂、火棉胶 致敏颗粒：载体吸附了可溶性抗原
间接血凝试验
将抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体， 在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集，称为间 接血凝试验(passive heamagglutination assay, PHA)
第
免疫血清学技术
用于检测抗原或抗体的体外
四
免疫反应技术或称免疫检测 技术，这一类技术因一般都
需用血清进行试验，通常称
讲
为免疫血清学反应或免疫血
清学技术
一、凝聚性试验
抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质 存在下，相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或 沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗 体或抗原，称为凝聚性试验
根据参与反应的抗原性质不同，分为由颗粒性 抗原参与的凝集试验和由可溶性抗原参与的沉 淀试验二大类
（一）凝集试验
细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应抗体 结合，在有适当电解质存在下，经过一定 时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝 集试验(agglutination test)。
参与凝集试验的抗体主要为IgG、IgM。 凝集试验可用于检测抗原或抗体。 凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式
将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样本中相 应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝 集，称为反向间接血凝试验(reverse passive heamagglutination assay, RPHA)。
乳胶凝集试验
聚苯乙烯乳胶是利用化工原料聚苯乙稀经过乳液聚合 得到的高分子乳胶液，乳胶微球直径约0.8m。
数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为 阳性反应。
本法主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断 (Ascoli试验)。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释 倍数，即为血清的沉淀价。
琼脂免疫扩散试验
琼脂的作用 抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例
适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可 见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散， 又简称琼脂扩散和免疫扩散。 ➢ 单向单扩散 单向双扩散 ➢ 双向单扩散 双向双扩散
常用直接法与间接法 将SPA标记FITC制成FITC-SPA
（二）酶标抗体技术
根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应 的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。
基本程序：标记－抗原抗体复合物－底物 根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应
的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相 应抗体或抗原的量呈正比。