生物酶解壳寡糖
壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性研究报告
国内对于壳寡糖的研究起步较晚，但 进展迅速。目前，国内已经有多个研 究机构和企业从事壳寡糖的研究和开 发工作，主要集中在化学法制备和酶 法改性方面。其中，酶法制备壳寡糖 是当前研究的热点之一，已有多个专 利申请。
目前，国内外对于壳寡糖酶法制备和 分离技术的研究主要集中在以下几个 方面：酶的选择与优化、制备工艺条 件的优化、分离纯化技术的改进等。 其中，分离纯化技术是实现壳寡糖工 业化生产的关键环节之一，需要研究 和开发更为高效、环保的分离纯化技 术。
优化级联分离
通过对多个级联分离的优化，降低能耗和减小废液排放。
04
壳寡糖的应用及市场前景
壳寡糖的应用领域
1
壳寡糖在医药、保健品和日用化工等领域的应 用已有广泛报道。
2
壳寡糖在农业领域具有防治植物病害、促进植 物生长等功效，受到广泛关注。
3
壳寡糖在食品、饲料和环保等领域也有着广泛 的应用前景。
壳寡糖的市场现状及发展趋势
温度控制
通过控制酶解反应的温度，提高壳寡糖的产量和 纯度。
时间控制
通过控制酶解反应的时间，使壳寡糖的产量达到 最佳。
湿度控制
通过控制酶解反应的湿度，保证酶解反应的顺利 进行。
设备选择
选择适合的设备，提高壳寡糖制备的效率和纯度 。
03
壳寡糖分离纯化技术的研究
壳寡糖分离纯化的一般方法
沉淀法
01
利用某些物壳寡糖的结构和性质，选择适合的酶种进行制备。
酶的制备
采用微生物发酵或基因工程等方法制备酶。
酶法制备壳寡糖的工艺流程
原料处理
将原料进行粉碎、干燥等预处理，以提高酶解效率。
酶解反应
将制备好的酶加入到原料中，控制温度、湿度等条件进行酶解反应。
用酶解法制备壳寡糖及其对机体免疫功能的调节作用
Ｙ ａ ｈ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｍａ ｒ ｉ ｎ ｅ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｏ ｃ ｅ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ， Ｑ ｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ ２ ６ ６ ０ ０ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
张 沛 韩宝 芹 陈列 欢 ② 彭 燕飞 刘 万顺 郑 汉东 杨 艳
（ 中国海洋 大学 海洋 生命 学院 ， 青岛 ２ ６ ６ ０ ０ ３ ）
中国 图 书 分 类 号 Ｒ ３ ９ ２ ． １ ２ 文献 标 识 码 Ａ 文章 编 号 １ ０ ０ ０ － ４ ８ ４ Ｘ（ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ － ０ １ ９ １ － ０ ６
胞对 Ｃ Ｏ Ｓ的吞噬作用几乎完全被抑制 。Ｃ Ｏ Ｓ被 巨噬细胞吞 噬后可显著增强 巨噬细胞 的吞噬功 能 ， 刺激 巨噬细胞 分泌 Ｔ Ｎ Ｆ 一 。
体 内研究结果表 明小鼠灌 胃 Ｃ Ｏ Ｓ能够显著增加小 鼠的脾脏指数 ， 增 加血清中 Ｉ ｇ Ｇ的含量 ， 对胸腺指数 和血清 中 Ｉ ｇ Ｍ 的含量没 有显著影 响。结论 ： 壳寡糖 （ ３ — ７聚合度 ） 能够被 巨噬细胞吞 噬 ， 进而激活 巨噬细胞 ， 具有较好 的体外 、 体 内免疫调 节功能 ， 壳 寡
［ 摘
要］ 目的 ： 研究本课题组 酶解制备的主要含 ３ ＿ ７聚合度壳寡 糖 （ Ｃ Ｏ Ｓ ） 对机 体免疫 功能 的调节作 用。方法 ： 利用本
课题组分 离的高活性壳聚糖酶通过酶水解 法制 备壳寡糖 ， Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ法对壳寡 糖的成分 进行鉴定 ， 并用 异硫氰酸荧 光素 （ Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ ） 将 壳寡糖进 行荧 光标记得到 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ — Ｃ Ｏ Ｓ ， 研究小 鼠腹腔 巨噬细胞对壳 寡糖 的吞噬作用及其与 Ｔ ｏ ｌ ｌ 样受体 ４ （ Ｔ Ｌ Ｒ ４ ） 的关系 ， 进一步 研究 了不 同浓 度壳 寡糖对小 鼠腹腔 巨噬细胞 的增殖 ， 吞噬 中性 红能力及 分泌 Ｔ Ｎ Ｆ — ｏ ｌ 能力的影响 ， 并 对小 鼠灌 胃不 同剂 量的壳 寡糖 ， 研究 了壳寡糖对小 鼠血清 Ｉ ｇ Ｇ和 Ｉ ｇ Ｍ含 量及 小鼠胸腺 、 脾脏 指数 的影响 。结果 ： Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ分析结果 显示壳 聚糖酶水解 法制 备的 Ｃ Ｏ Ｓ主要为 ３ 单糖聚合度 的寡糖 。将 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ — Ｃ Ｏ Ｓ作用于小 鼠腹 腔巨噬细胞不 同时 间后 ， 荧光显 微镜观察 结果表 明巨噬 细胞能够吞 噬 Ｃ Ｏ Ｓ ， 随着时 间的延长吞 噬 Ｃ Ｏ Ｓ的量增 加 ， Ｔ Ｌ Ｒ ４单克隆抗体预处理 巨噬细胞 ｌ 小时后再加 入 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ — Ｃ Ｏ Ｓ ， 巨噬细
酶解法制备壳寡糖的工艺探索
壳寡糖（COS）来源广泛、安全无毒、水溶性好，具有降低血脂、抗氧化、抑菌、抗癌肿瘤、提高免疫力等多种生物活性［1-2］。
由甲壳素脱乙酰基制得的壳聚糖分子量大，其应用受到很大限制，而酶法降解壳聚糖反应条件温和且易控制、安全性高、环境污染少［3-5］。
因此，在前人研究基础之上，本研究采用纤维素酶代替成本昂贵的专一性酶降解壳聚糖，通过正交实验，得最佳降解工艺条件，为壳寡糖的制备提供新思路。
1材料与方法1.1实验材料壳聚糖（批号：181211A，脱乙酰度> 95％），某生物科技有限公司；纤维素酶DE-52（产品编号：C8350-100，From Whatman4057-200），北京索莱宝科技有限公司；D-氨基葡萄糖盐酸盐（批号：HL180930Y），山东莱州市海力生物制品有限公司；再生纤维素透析膜（货号：QABO-SP132592-1m截留分子量1000），上海安谱实验科技股份有限公司；冰乙酸，无水乙酸钠，氢氧化钠，无水乙醇，3，5-二硝基水杨酸，焦亚硫酸钠，酒石酸钾钠，苯酚。
1.2仪器设备电子天平，电热恒温鼓风干燥箱，紫外分光光度计，pH计，旋转粘度计。
1.3实验方法溶液的配制。
0.2mol/L醋酸配制：吸取11.3mL冰醋酸溶液于1L容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成0.2mol/L的醋酸溶液。
0.2mol/L的醋酸钠的配制：准确称量16.2g无水醋酸钠溶于蒸馏水中，移液至1L的容量瓶中定容，配成0.2mol/L的醋酸钠溶液。
pH5.2醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制：吸取0.2mol/L的醋酸溶液和0.2mol/L的醋酸钠溶液混合配制缓冲溶液，用pH计测量pH在5.2。
壳聚糖溶液的配制：准确称取1.0g壳聚糖原料溶于100mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH5.2的1.0%的壳聚糖溶液。
酶液的配制：准确称取0.4g纤维素酶溶于100mL 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH5.2的4g/L的酶液。
DNS试剂的配制：准确称取7.5g 3，5-二硝基水杨酸（DNS试剂）和14.0g氢氧化钠充分溶解于1000mL水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6mL预先在50℃水中溶化的苯酚和6.0g焦亚硫酸钠，充分溶解后，盛于棕色瓶中，放置5d稳定后，即可使用。
壳寡糖的新用途的制作流程
本申请属于农业领域，公开了壳寡糖在防治番茄幼苗潜叶蝇的新用途。
壳寡糖原材料来自于虾蟹壳，来源天然环保，采用先进的生物酶解法制备，加工工艺绿色、安全，壳寡糖分子量低，水溶性好，易被生物体吸收。
同时壳寡糖在促进有益微生物的生长，提高植株抗逆性和对多种细菌、真菌、病毒等产生免疫杀死作用方面均具有重要意义。
试验表明在番茄育苗中，采用叶面喷施壳寡糖溶液时，一定程度上可以缓解虫害，减少番茄幼苗病株数。
由于壳寡糖较高的水溶性与安全性，对操作者的技术要求较低，且不会对生物体造成伤害，是一种绿色环保、安全有效的农业制剂。
权利要求书1.壳寡糖在防治番茄幼苗潜叶蝇的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，所述壳寡糖分子量为1000-3000Da。
3.根据权利要求1所述的用途，所述壳寡糖浓度为25-150mg/L。
4.根据权利要求3所述的用途，所述壳寡糖浓度为100mg/L。
5.根据权利要求1所述的用途，所述壳寡糖作用于番茄幼苗的时期为子叶展平至五到六片叶。
6.一种防治番茄幼苗潜叶蝇的方法，在番茄幼苗子叶展平后，将壳寡糖混合液通过叶片喷施方式作用于番茄幼苗，每盘幼苗壳寡糖混合液的用量为1/3L/d。
7.根据权利要求6所述的方法，所述壳寡糖混合液为壳寡糖水溶液或壳寡糖溶于水溶性的溶剂制得的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，所述壳寡糖混合液中壳寡糖浓度为25-150mg/L，壳寡糖分子量为1000-3000Da。
技术说明书壳寡糖的新用途技术领域本技术属于农业领域，具体涉及壳寡糖的新用途，尤其是涉及壳寡糖在防治番茄幼苗潜叶蝇的用途。
背景技术潜叶蝇是蔬菜生产中常见的虫害，以幼虫潜入叶片内取食叶肉，在叶面留下不规则线形形状。
高温高湿条件下易引发潜叶蝇虫害，夏季为虫害高峰期。
在番茄幼苗生长过程中，在2-7叶时易受潜叶蝇虫害，且受害严重时，潜痕密布，叶片发黄脱落，严重影响其叶片光合作用，不利于幼苗生长，进而影响蔬菜的生长，而后期也会影响其产量和品质。
壳寡糖制备方法综述
壳寡糖制备方法综述壳寡糖是一种具有重要生物活性的天然多糖，主要存在于甲壳类动物的外壳和软体动物的软体中。
壳寡糖具有广泛的应用领域，包括医药、食品和农业等。
目前，制备壳寡糖的方法主要有酶法、酸法、碱法和微生物法等。
本文将对这些方法进行综述。
酶法是一种常用的壳寡糖制备方法。
该方法通过使用壳寡糖酶将壳聚糖水解成较短的寡糖片段。
紧接着，使用酶抑制剂或通过温度和pH的调控来停止反应，制备壳寡糖。
这种方法具有反应温和、产率高的优点，但也存在酶价格昂贵和反应时间长的缺点。
酸法是另一种常用的壳寡糖制备方法。
该方法通过酸催化将壳聚糖水解成寡糖片段。
酸法可以使用无机酸如盐酸或有机酸如甲酸等。
可以通过改变反应条件如酸浓度、反应时间和温度来控制壳寡糖的产率和分子量。
然而，酸法也存在酸浓度高反应剧烈、产率低的问题。
碱法是制备壳寡糖的另一种方法。
该方法通过碱催化将壳聚糖水解成寡糖片段。
碱法具有反应温和、产率高的特点，但在反应过程中会生成较多的废碱。
此外，碱法的反应条件也需要控制，以避免过度水解。
微生物法是近年来逐渐发展起来的一种壳寡糖制备方法。
该方法通过利用具有壳聚糖酶活性的微生物如腐霉菌、异戊糖原杆菌等来酶解壳聚糖。
微生物法具有高产率、选择性强等优点，但需要较长的反应时间。
除了以上几种方法，还有一些新的壳寡糖制备方法也值得关注。
例如，超临界流体法、离子液体法和微波辅助法等。
超临界流体法通过改变压力和温度，将壳聚糖水解成寡糖片段。
离子液体法使用离子液体作为催化剂，实现壳寡糖的水解反应。
微波辅助法利用微波的能量来加速水解反应的进行。
综上所述，壳寡糖具有重要的生物活性，制备壳寡糖的方法主要有酶法、酸法、碱法和微生物法等。
每种方法都有其特点和局限性。
随着科学技术的进步，新的壳寡糖制备方法也将不断涌现，为壳寡糖的应用提供更多选择。
生物酶法制备壳寡糖的现状与未来
生物酶法制备壳寡糖的现状和展望壳寡糖(Chitosan oligosaccharide)，是以氨基葡萄糖为单体通过β-1,4-糖苷键连接的不同聚合度的混合物。
其水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品，分子量小于3000Da。
随着对壳寡糖功能的深入研究，壳寡糖在农业、食品、日用化工、医药等各大领域有突出的效果。
农业上，壳寡糖的抑菌、抗病毒效果，可开发无公害生物农药，它的别称是氨基寡糖素。
另外，壳寡糖促进植物的营养生长，作为零污染的肥料；食品工业方面，壳寡糖具有提高免疫力，抗氧化，降三高的良好功能，是许多食品、保健品追捧的新食品原料；日用化工上，壳寡糖的吸水保湿功效，许多面膜、护肤品等都添加了壳寡糖；壳寡糖具有抗肿瘤、降血压等医疗功效，甚至可以作为疫苗的佐剂，为新药的开发提供思路和原料。
壳寡糖的功能决定着它的巨大市场需求，市场就推动了壳寡糖产业的发展。
目前壳寡糖工业化的生产主要是两种方法：一、物理化学法，通过机械粉碎虾蟹壳，用强碱去蛋白，无机酸脱盐制成壳聚糖，再用微波辐射或强酸降解壳聚糖生产壳寡糖；二、生物酶法，用生物酶降解壳聚糖生产壳寡糖。
物理化学法生产壳寡糖，高污染低质量受到了政府的制约和市场的淘汰，现市面上优质的壳寡糖产品绝大多数是生物酶法生产。
对于第二种方法生产壳寡糖有如下展望。
第一、发现并利用具有更优性质的生物酶目前，商业化的水解酶有溶菌酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、半纤维素酶对甲壳素和壳聚糖的水解有或多或少的催化效果 [1]. 这些非特异性酶连同特异性的甲壳素酶、壳聚糖酶、糖基转移酶等混合使用很可能开辟最优生物酶法制备壳寡糖的新道路。
虽然不同的非特异性酶有用来以壳聚糖或甲壳素为原料制备壳寡糖，但由于此类酶的水解能力有限，所以探寻更优特质水解酶是有市场需求的。
譬如，分支酶Branchzyme，可作用于壳聚糖并生成聚合度为2-20的壳寡糖，其中聚合度3-8的比例非常高[3]。
研究甲壳素或壳聚糖降解时中会发现，最初的步骤都是考虑将它们溶解，如果有能够直接降解结晶多糖的酶那就是省时高效的工业简化。
壳寡糖与对人体健康的有利作用
壳寡糖与对人体健康的有利作用壳寡糖（chitosan oligosaccharides）是一种天然产物，它是从壳聚糖（chitosan）中经过特殊酶解技术或酸碱法提取而得到的短链寡糖。
壳寡糖具有多种生物活性，对人体健康有许多有益作用。
首先，壳寡糖具有抗菌作用。
研究表明，壳寡糖能够抑制多种细菌的生长，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见病原菌。
这是因为壳寡糖具有多种抗菌机制，如改变菌膜通透性、干扰细菌代谢等。
因此，壳寡糖可以用作食品保鲜剂和抗菌剂，促进食品安全和质量。
其次，壳寡糖对肠道健康有益。
壳寡糖可以增加有益菌（如乳酸菌）数量，抑制有害菌（如致病菌）生长，维持肠道菌群平衡。
正常肠道菌群对于消化、吸收和免疫功能的维持都至关重要。
壳寡糖还能增加肠道黏膜细胞的黏液分泌，提高肠道屏障功能，减少有害物质通过肠道进入体内。
另外，壳寡糖还能够促进肠道蠕动，预防和缓解便秘。
因此，壳寡糖对于改善肠道健康、促进消化吸收具有积极的作用。
此外，壳寡糖对血脂调节有一定功效。
研究发现，壳寡糖能够降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的水平，增加高密度脂蛋白胆固醇的含量，从而改善血脂代谢。
这可能是因为壳寡糖能够抑制胆固醇吸收和合成，并增加胆酸排泄。
因此，壳寡糖对降低血脂、预防心血管疾病具有重要意义。
壳寡糖还具有其他多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等。
抗氧化作用是指壳寡糖能够中和自由基、抑制脂质氧化反应，减少细胞氧化损伤。
抗肿瘤作用是指壳寡糖能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移。
免疫调节作用是指壳寡糖能够增强机体免疫功能，调节免疫细胞的活性和数量。
这些作用对于预防和治疗多种疾病或症状具有重要意义。
然而，需要注意的是，每个人的体质不同，对壳寡糖的耐受性也不同。
一些人可能对壳寡糖过敏或引发胃肠道不适反应。
因此，在使用壳寡糖时要遵循适量原则，不可过量使用。
总之，壳寡糖作为一种天然产物，具有多种有益作用，包括抗菌、促进肠道健康、调节血脂、抗氧化等。
概述壳寡糖的制备方法
概述壳寡糖的制备方法壳寡糖是一种多糖化合物，由壳聚糖经酸性水解或酶解而得。
壳聚糖是一种天然存在于海洋中的多糖，具有许多生物活性和应用价值，如抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等。
壳寡糖是壳聚糖的降解产物，具有更小的分子量和活性基团，因此其生物活性更高。
壳寡糖的制备方法主要有以下几种：1.酸性水解法：将壳聚糖溶解在酸性溶液中，如醋酸、盐酸等，并在适当温度下加热反应。
酸性条件可以使壳聚糖链断裂，生成壳寡糖。
反应结束后，通过中和酸性溶液或沉淀法将产物分离出来。
2.酶解法：使用壳聚糖酶或其他适用的酶对壳聚糖进行酶解反应。
酶解过程中，酶可以选择性地断裂壳聚糖链，生成壳寡糖。
酶解反应可以在适宜的温度和pH值下进行，并通过酶的活性和反应时间来控制产物的数目和分子量。
3.化学修饰法：通过化学反应将壳聚糖的部分功能基团修饰成壳寡糖。
例如，可以通过酯化反应在壳聚糖分子上引入乙酰基等基团，从而生成壳寡糖。
化学修饰法可以根据需要选择适合的修饰试剂和反应条件，并通过改变反应物的摩尔比例和反应时间来控制修饰程度和产物的分子量。
4.高效液相色谱法：通过高效液相色谱（HPLC）技术从壳聚糖中分离壳寡糖。
HPLC分离通常使用聚合物或凝胶柱，通过调节流动相的组成、流速和梯度来实现壳寡糖的分离。
此方法具有高分离效率和纯度，但对仪器的要求较高，因此成本较高。
壳寡糖的制备方法选择取决于所需壳寡糖的数目、分子量和纯度，以及实验室条件和经济成本。
不同的制备方法也会对壳寡糖的结构和性质产生影响，因此需要根据研究目的和应用要求选择最合适的方法。
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生物酶解壳寡糖
壳寡糖又称壳聚寡糖、低聚壳聚糖、甲壳寡聚糖、氨基寡糖素等，是一种通过降解甲壳素或壳聚糖得到的聚合度在2~20之间的寡糖产品，是甲壳素、壳聚糖产品的升级产品；壳寡糖是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖，是动物性纤维素。
具有分子量低、水溶性好、功能作用大、更易被吸收等特点。
以海洋生物虾、蟹壳为原料，通过脱钙、脱蛋白后获得甲壳素，甲壳素通过酶解或强碱水解后脱去部分乙酰基获得壳聚糖，壳聚糖通过酶解或酸解得到壳寡糖。
乐满地生物酶解壳寡糖：采用生物酶解技术制成壳寡糖，具有降解条件温和、无副反应、脱乙酰度高、分子量小，壳寡糖生物活性高等特点。
含量：5%、10%
PH 值：6.5-7
分子量：≤ 2000Da
脱乙酰度：≥97%
状态：黄褐色液体
壳寡糖主要特性：
1、改良土壤：壳寡糖能促进有益微生物的生长繁殖，显著减少土壤有害菌及线
虫类，促进土壤团粒结构形成，改善土壤理化性质，增强透气性和保水保肥能力，为根系提供良好的土壤微生态环境。
2、提高肥效：壳寡糖能活化养分，使氮、磷、钾等养分能得到植物充分有效地
吸收，提高养分利用率，提高肥效，减少化学肥料用量；壳寡糖能螯合铁、铜、锌、锰、钼等微量元素，使肥料中微量元素有效态养分增加，同时使土壤中固定的微量元素养分释放出来，容易被作物吸收利用。
3、促进生长：壳寡糖是一种新型的生物刺激素，能促进根系生长，促进根部伤
口愈合及发育，作物根系发达，根毛、须根、次生根数量大大增加，增强植物吸收水肥能力，提高抗旱能力，促使茎秆粗壮，有利于养分供应传输，提高抗倒伏能力。
4、激发作物免疫系统：壳寡糖可诱导植物抗性，增强作物抗病、抗旱、抗冻能
力；壳寡糖可诱导植物产生抵御病原物质的抗性蛋白，抑制病菌的生长，诱导木质素形成，促进伤口愈合，壳寡糖对病害具有广谱性的抵御作用，增强作物对病毒病、真菌、细菌、线虫等病害的抵抗能力，减少农药使用，同时能缓解作物因肥害、药害产生的影响。
5、增产提质：壳寡糖是一种天然的植物营养生长促进剂，能增加营养吸收力，
有效促进植物生长，增加作物产量，壳寡糖能促进钙离子吸收，减少裂果等缺钙症状，提高座果率，促进微量元素吸收，增加甜度、促进早熟、延长保险贮藏期，提升作物品质。