第二章 生物酶解技术

验证试验:按原醇提取工艺进行3次试验,同时根据 正交试验优选结果对酶解工艺进行3次重复试验,结果 见表3。可见,两工艺重现性良好,但是加酶工艺比不加 酶收率提高了3.92%。
同样酶解技术可以用于提取黄酮类，皂苷 类，苯丙素类，有机酸类，蛋白质类，挥 发油。
二、酶解技术在中药成分转化中的应用 研究证明,白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过 敏、降血脂和抗氧化等多方面的药理活性,是目前 研究较热门而有希望的抗癌药剂之一。 白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在,因此, 作者考虑将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元,这将 大大提高白藜芦醇的得率。（虎杖提取用乙醇）
3. 酶的比活力
指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数
比活力 ＝
酶活力单位数（U） 酶蛋白质量（mg）
比活力是酶制剂纯度的常用指标 —— 比活力越大，表示酶越纯
三、影响酶活性的因素
酶解提取中药有效成分，均有较高收 率，具有较大应用潜力，但该技术也 存在着局限性。酶法提取对生产条件 要求较高，为使酶发挥最大作用，并 将其用于工业化时，必须综合考虑酶 的浓度和底物浓度，温度，pH，作用 时间等对提取物的影响。
2. pH对酶反应速度的影响
pH对酶反应速度的影响较大。其原因有：
pH影响酶分子解离状态。
pH影响底物的解离，从而影响酶与 底物的结合。 极端pH的条件引起酶蛋白的变性。 每种酶只能在一定的pH范围内表现出它 的活性，且在某一pH值范围内活性最高， 其两侧活性都下降。∴ 酶促反应具有一最 适pH。
（二）酶解温度
温度升高加速化学反应
但酶的本质是（ 范围（ 度范围内活性随（ 过实验考查来确定。 ）所以温度超过一定 )升高而（ ）。 ）所以对同一种酶在一定温
对于对不同药材酶的最适合的温度可以通
方法
实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究
固定酶的用量，作用时间，酶解液的PH值 等相同的条件，将酶解液分成若干份，分 别控制不同的温度进行酶解反应，测定代 表性的有效成分为考查指标，根据含量多 少确定最合适的酶解温度
1. 温度对酶反应速度的影响
温度对酶反应速度的影响具有双重性：
随着温度的升高，反应速度会加快 随着温度的升高，酶蛋白会失 活，使反应速度下降
因此，在这双重因素的综合作用
下，酶促反应具有一最适温度。
四. 温度对酶反应速度的影响
不同酶的最适温度也不一样。动物酶的最适温度 一般在35~40℃，植物酶为40~50℃。 酶的最适温度并非酶的特征性常数，它与底物、作 用时间等因素有关。
是酶的辅助因子，有的是酶的辅助因子
的必要成分。 如: 激酶需要Mg2+激活
唾液淀粉酶需要Cl-激活
5. 激活剂对酶反应速度的影响
有机小分子： 一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨
酸，使含-SH的酶处于还原态
金属螯合剂，如 EDTA( 乙二胺四乙
酸 ) ，可络合一些重金属杂质，解除它
们对酶的抑制，从而使酶活升高。
单因素考查法（一）温度
（二）酶用量
酶解温度55，pH6.5酶解2小时纤维素酶
（三）酸碱度
固定纤维素酶的量，酶解温度，时间2h， 考查pH影响。
（四）酶解时间
固定：纤维素酶量，酶解温度55pH6.5考查 不同时间
二、酶解技术的工艺设计
实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究 1.酶解液黄酮成分测定 2.正交实验设计
6. 抑制剂对酶反应速度的影响 抑制作用：有些物质与酶结合后，引起酶的活 性中心或必需基团的化学性质发生改变，
从而使酶活力降低或丧失。
第三节 生物酶辅助提取中药成分的机制
原理
酶解破壁
纤维素酶 解提取
有效成分的提取
内切葡聚糖酶 纤维素酶 纤维素二糖水解酶 β-葡萄糖苷酶 β甘露聚糖酶 半纤维素酶 β-木聚糖酶 β-葡萄糖苷酶 β-甘露糖苷酶 β-木聚糖苷酶 果胶酶 聚α-1,4半乳糖醛酸的聚糖水解酶 果胶质酰基水解酶
（二）生物碱
生物碱一般采取方法？ 酶法辅助提取率比传统方法显著增加，生 物碱结构无（ )键， 不存在被酶水解问题。 实例3.贝母生物碱酶 辅助提取工艺研究 （1）酶解条件单因素 考查
（2）酶解条件正交试验
温度
pH
由极差分析得到各因素对提取效果的影响度:A>D>B>C, 由此可见,酶解温度为主要因素,酶解时间为次要因素,其 次是pH值,而酶用量的影响最小。因此得到最佳提取条件: 提取温度为60℃,pH值为45,酶用量为2.5g/L,提取时3.5h
以70%乙醇为空白参比,10min后用1cm比色 皿于510nm测定吸光度,得芦丁的回归方程: Y=0.0749A+0.0022(R2=0.9961)。 苦荞茎总黄酮的测定:准确称取2.50g苦荞茎 叶粉,于250mL三角瓶中,加入50mL水,按试验 设置的处理条件,在不同的加酶量、酶解温度 和pH值条件下,酶解不同的时间,然后升温至 90℃提取,离心去沉淀,用70%乙醇定容至 200mL,作为待测液。取3mL待测液于50mL 量瓶中,按照标准曲线的制备项下方法测定吸 光度,计算总黄酮的质量,并计算总黄酮得率 (总黄酮得率=提取液中总黄酮质量/苦荞茎叶 粉质量×100%)。
某些物质能使酶的活性增强，成为酶
的激活剂，某些物质能使酶的活性降
低，成为酶的抑制剂。
再如一些金属螯合剂如EDTA（乙二胺
四乙酸）等能除去重金属离子对酶的
抑制作用，也可视为酶的激活剂。
5. 激活剂对酶反应速度的影响
激活剂：能提高酶活性的物质。 主要的激活剂有： 无机离子： 主要是金属离子，它们有的本身就
反应速度和pH的关系见下图：
2. pH对酶反应速度的影响
酶的最适pH一般在7左右。也有很多例外，如胃蛋白 酶 的 最 适 pH 只 有 1.5 ， 木 瓜 蛋 白 酶 (5.6) ， 胰 蛋 白 酶 (7.8) 。酶的最适 pH 并非酶的特征性常数，它与底物的 种类、浓度等因素有关。
3.底物浓度的影响
1. 酶活力概念
酶的定量并非对其蛋白质进行定量， 而是对它的催化能力进行定量。
所以，酶的定量就是测定酶的活力，
也即测定酶促反应的速度。
2. 酶活力与单位
A.国际单位 (U)
这种单位是由国际酶学委员会规定的。 在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下， 酶每分钟催化 1 mmol 底物转化，这样的速度所代 表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。
一、 酶的概念
酶的概念—酶是由生物细胞产生的以蛋白质
为主要成分的生物催化剂。
生物体内的反应是在很温和的条件（
如温和的温度、接近中性的pH）下进
行的，而同样的反应若
在非生物条件下进行，则需要高温、
高压、强酸、强碱等剧烈的条件。
第二节酶反应的特点与影响酶活性的因素
一、酶反应的特点 酶的高效性 酶的专一性
第五节 酶解技术在中药提取中的应用
一、酶解技术在中药成分提取中的应用 （一）多糖 实例2.甘草多糖的酶辅助提取 运用正交设计法设计酶法提取工艺，采用 分光光度法测定多糖含量。【结果】酶法 提取甘草多糖的最佳工艺是温度40℃、pH 值5.0、加酶量5g•kg(-1)、提取时间5h。提 取率3.29%酶法提取甘草多糖速度快，提取 率高。
第二章 生物酶解技术
细胞壁的层次
生物酶解技术在中药提取 中的应用
胞间层（中层）(middle lamella):果胶类物质组成， 具强的亲水性和可塑性。 初生壁(primary wall)： 细胞生长过程中，原生质 分泌，有纤维素、半纤维 素和果胶，还含有酶和糖 蛋白。 次生壁(secondary wall)： 细胞停止生长，原生质产 生的壁物质沉积在初生壁 内侧。由纤维素、半纤维 素和木质素构成。分内层 (S3)、中层(S2 )和外层S1 )。
2.复合酶的作用
由于植物组织细胞壁的多样性，有时采用 复合酶，但由于复合酶的作用广泛应考虑 对有效成分的多重影响。 有效成分含量明显超过单一酶 复合酶 综合作用 有效成分含量低于单一酶
复合酶解法提取三七皂苷结果比较
提取方法 皂苷含量(%) 平均
纤维素酶解法 9.46 8. 78 9.46 9.23 果胶酶酶解法 8.90 8.64 9.16 8.90 复合酶解法 11.26 11.38 10.97 11.17
酶的催化效率是无机催 化剂的107 ~1013 倍 每一种酶只能催化一种 或一类的化学反应 酶所催化的反应一般是 在比较温和的条件下进 行的。
酶的作用条 件较温和
二、酶活力与酶单位
酶活力:是酶促反应的能力。酶活力大
小就是指在一定条件所催化的某一化
学反应速度的快慢，即酶催化的反应
速度越快，酶活力越高，反之则表示 该酶活力低。
酶解优点
4.
提高提取率
3.
加速有效成分释放
2.
将植物组织温和分解
1.
选用纤维素酶
第 四节 生物酶解辅助提取条件优选
一、酶辅助提取条件的优选 植物根茎类药材——纤维素酶 种子药材——纤维素酶、半纤维素酶 花类、果类——选用果胶酶 动物药材——蛋白酶
（一）酶的种类
1.酶对有效成分的影响 催化水解酶(纤维素酶）对苷类药材的影响P48
细胞壁的化学组成
纤维素(cellulose): 由葡萄糖分子串联而成。 结构单位：微团(micelle) 、微纤丝(microfibre) 、 大纤丝(macrofibre) 纤维素的网络结构中交联半纤维素和果胶类物质。
第一节 概述
目前，生物酶技术在现代中药提取中正展
示着其独特的优势，引起了许多企业和科 研单位的关注，并已经开始了在这一领域 的探索和应用。世界上广泛开展了有关酶 的性质的研究，至今已从动物，植物中发 现了两千多种酶，并有两百多种酶已得到 结晶。
多糖的酶及超声联合提取