核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制
肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化
肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化莫翠菊;秦雪;康晓楠;彭契六;江凯;卢宇;隋靖喆;翟励敏;刘银坤【摘要】目的应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱.方法应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型.通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果.结果诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA 的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强.提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端a或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺p 1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多.结论肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】7页(P198-204)【关键词】凝集素芯片;糖谱;肝癌(HCC);上皮间质转化(EMT);肝细胞生长因子(HGF)【作者】莫翠菊;秦雪;康晓楠;彭契六;江凯;卢宇;隋靖喆;翟励敏;刘银坤【作者单位】广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学生物医学研究院上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;复旦大学生物医学研究院上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;复旦大学生物医学研究院上海200032【正文语种】中文【中图分类】R392.12蛋白质糖基化是翻译时一种重要的共修饰方式，蛋白质糖基化修饰伴随多种肿瘤的发生和侵袭转移，并会随着病情而改变[1]。
GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究的开题报告
GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的
研究的开题报告
标题：GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究
背景介绍：Glypican-3（GPC3）是一种Glypican家族的膜结合型糖蛋白，在人类肝癌组织及10个肝癌细胞株中高度表达，目前认为是一种肝癌特异性抗原。
GPC3在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用，包括在肝癌细胞增殖、侵袭和氧化应激中的调节作用。
因此，GPC3成为肝癌诊断和治疗的一个重要靶点。
本研究旨在探讨GPC3在肝癌Huh-7细胞中的生物学功能和作用机制。
研究方法：本研究将采用基因转染技术过表达GPC3基因，以正常Huh-7细胞为对照组，通过Western blot和RT-PCR检测GPC3的表达水平。
利用MTT法和Clone Formation实验检测GPC3对Huh-7细胞增殖和生长的影响。
采用Transwell实验探讨GPC3对Huh-7细胞侵袭和迁移的影响。
并利用流式细胞术检测GPC3对Huh-7细胞氧化应激的调节作用。
预期结果：经过GPC3过表达、实验后，预计可以显著提高Huh-7细胞的增殖和生长能力；增强Huh-7细胞的侵袭和迁移能力，并且能抑制氧化应激反应。
这些结果将有助于深入研究GPC3在肝癌细胞中的作用机制，为肝癌的治疗提供新的思路和靶点。
丹酚酸B抑制HuH-7细胞的Hippo
网络出版时间：２０２４－０１－１０１０：５２：５８ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０１０８．１８３１．０３２丹酚酸Ｂ抑制ＨｕＨ ７细胞的Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰ通路机制研究余新梅１，李利利１，张 傲２，邓 洁３，杨 雁１（安徽医科大学１．基础医学院、２．第一临床医学院、３．第二临床医学院，安徽合肥 ２３００３２）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０９０５９文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０１－０１０６－０８中国图书分类号：Ｒ９６７、Ｒ３９２ ５、Ｒ３９２ １２摘要：目的 探讨丹酚酸Ｂ（ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃａｃｉｄＢ，ＳａｌＢ）对人肝癌ＨｕＨ ７细胞是否具有抑制作用，并探讨其是否通过Ｈｉｐ ｐｏ／ＹＡＰ信号通路发挥作用。
方法 采用ＴＧＦ β１（９ｐｍｏｌ·Ｌ－１）或ＭＳＴ１／２抑制剂ＸＭＵ ＭＰ １（５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１）刺激ＨｕＨ ７细胞，用ＳａｌＢ（５０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理ＨｕＨ ７细胞。
用ＣＣＫ ８和ＥｄＵ检测细胞增殖情况，用细胞划痕实验检测细胞迁移情况，用免疫荧光染色法检测ＹＡＰ和ＴＡＺ的表达和分布，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｐ ＭＳＴ１、ＭＳＴ１、ｐ ＹＡＰ、ＹＡＰ、ｐ ＴＡＺ、ＴＡＺ和ＣＴＧＦ的蛋白表达水平。
结果 ＳａｌＢ抑制了ＴＧＦ β１或ＸＭＵ ＭＰ １刺激的ＨｕＨ ７细胞的增殖。
同时，ＳａｌＢ抑制了ＴＧＦ β１刺激的ＨｕＨ ７细胞的迁移。
值得注意的是，与ＸＭＵ ＭＰ １对ＨｅｐＧ２细胞迁移能力的促进作用不同，ＸＭＵ ＭＰ １在本实验中不能明显促进ＨｕＨ ７细胞的迁移。
此外，ＳａｌＢ可上调ｐ ＭＳＴ１、ＭＳＴ１、ｐ ＹＡＰ、ｐ ＴＡＺ的蛋白表达，降低ＹＡＰ、ＴＡＺ、ＣＴＧＦ的表达。
结论 ＳａｌＢ抑制ＨｕＨ ７细胞的作用可能与激活Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰ信号通路有关。
靶向抑制mir-20b降低肝癌huh-7细胞增殖、迁移和侵袭能力
摘要：目的 探讨 ｍｉＲ２０ｂ对肝癌 ＨｕＨ７细胞增殖、迁移、侵袭的影响和机制。方法 在肝癌 ＨｕＨ７细胞中转染 ｍｉＲ２０ｂｉｎ ｈｉｂｉｔｏｒ，分别采用 ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ评估下调效果，ＭＴＴ法评估细胞增殖变化，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室评估细胞侵袭能力，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法评 估细胞中 ＭＭＰ２、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＭＰ９和 ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白水平。应用生物信息学软件预测 ＴＣＦ２１可能是 ｍｉＲ２０ｂ的靶基因，以双 荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在肝癌 ＨｕＨ７细胞中共转染 ＴＣＦ２１ｓｉＲＮＡ和 ｍｉＲ２０ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，评估细胞增殖、侵袭、迁移 与细胞中 ＭＭＰ２、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＭＰ９、ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白的表达水平。结果 转染 ｍｉＲ２０ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ后 ＨｕＨ７细胞中 ｍｉＲ２０ｂ表达 水平降低［（１０２±０１１）ｖｓ（０４３±００５）］；细 胞 增 殖 ［（０５７±００６）ｖｓ（０３４±００２）］、迁 移 ［（１２５６４±１３６５）ｖｓ（９２１４± ６９４）］和侵袭［（８８１５±９３２）ｖｓ（６３４８±６２）］能力下降；ＭＭＰ２、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＭＭＰ９蛋白表达水平降低；Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达 水平升 高。ｍｉＲ２０ｂ靶 向 负 调 控 ＴＣＦ２１表 达。共 转 染 ＴＣＦ２１ｓｉＲＮＡ和 ｍｉＲ２０ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ可 以 显 著 提 高 ＨｕＨ７细 胞 增 殖 ［（０４０±００５）ｖｓ（０５６±００６）］、迁移［（８９６２±９２５）ｖｓ（１１５２６±１０８４）］和侵袭［（６８２５±４１５）ｖｓ９５２１±６５１）］能力； 提高细胞中 ＭＭＰ２、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＭＭＰ９蛋白表达水平，降低 Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白水平；与共转染 ｓｉＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ和 ｍｉＲ２０ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ的 细胞比较，差异有统计学意义（Ｐ＜００５）。结论 下调 ｍｉＲ２０ｂ表达，可通过靶向 ＴＣＦ２１抑制肝癌 ＨｕＨ７细胞的增殖、迁移、 侵袭和上皮 －间质转化。 关键词：肝肿瘤；ｍｉＲ２０ｂ；ＴＣＦ２１；侵袭 中图分类号：Ｒ７３５７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－７３９９（２０１９）１０－１１６２－０６ ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１９．１０．００６
TMEM64在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭
TMEM64is highly expressed in hepatocellular carcinoma and promotes tumor cell proliferation and invasionCAO Danping 1,CAI Juan 2,LI Yanna 1,DONG Runyu 1,WANG Zhixiong 1,ZUO Xueliang 11Department of Gastrointestinal Surgery,2Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital),Wuhu 241001,China摘要：目的分析TMEM64在肝癌中的表达情况及对肝癌患者预后评估价值，探讨TMEM64对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。
方法采用癌症基因组图谱（TCGA ）数据库和基因型组织表达项目（GTEx ）分析TMEM64在肝癌中表达水平。
采用Wilcoxon 秩和检验方法比较分析TMEM64基因在肝癌和癌旁组织中的表达差异。
利用Kaplan-Meier 曲线和Cox 回归分析评估TMEM64的表达水平对肝癌患者总生存期的影响及预后预测价值。
通过单样本基因富集分析评估TMEM64的表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性。
依据TMEM64表达水平及相关临床变量构建基于总体生存率的nomogram 图并进行验证。
细胞实验中，在HCCLM3细胞中敲低TMEM64，分为si-NC （对照组）、si-TMEM64#1（敲低组1）、si-TMEM64#2（敲低组2）3个组；在Huh7细胞中过表达TMEM64，并分为vector （对照组）和TMEM64（过表达组），采用CCK-8、EdU 和克隆形成实验检测TMEM64对肝癌细胞增殖的影响，使用Transwell 和细胞划痕实验验证TMEM64对肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变。
小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响
小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响赵锦燕;刘丽雅;张毓宸;洪振丰【期刊名称】《世界中西医结合杂志》【年(卷),期】2016(0)6【摘要】目的观察小柴胡汤对体外培养人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响及相关机制。
方法不同浓度小柴胡汤(0,0.5,1.0,1.5 mg/ml)处理人肝癌Huh7细胞24 h、48 h和72 h后,利用倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活力,Hoechst 33258染色观察不同浓度小柴胡汤对凋亡的影响,RT-PCR和Western blot检测Bax和Bcl-2的表达。
结果不同浓度小柴胡汤作用Huh7细胞24 h能不同程度抑制细胞生长,MTT结果表明小柴胡汤干预Huh7细胞24 h、48 h和72 h,能显著抑制细胞活力,呈时间和剂量依赖性;小柴胡汤作用Huh7细胞24 h,细胞呈明显的凋亡特征;RT-PCR和Western blot结果表明,小柴胡汤促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,与对照组比较差异有统计学意义。
结论小柴胡汤促进Bax表达,抑制Bcl-2表达可能是其促进Huh7细胞凋亡的机制之一。
【总页数】4页(P746-749)【关键词】肝癌;小柴胡汤;细胞凋亡【作者】赵锦燕;刘丽雅;张毓宸;洪振丰【作者单位】福建中医药大学中西医结合研究院福建省老年性疾病重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R285【相关文献】1.QHF复方对人肝癌Huh7细胞生长、侵袭及肿瘤干细胞表面标志物表达的影响[J], 刘丹;焦良波;张文;王心怡;陈涛;胡卫2.QHF复方对人肝癌Huh7细胞生长凋亡、侵袭能力的作用及其对肿瘤干细胞表面标志物的影响 [J], 王萍;姬生威;朱晓东;罗红兰;付强3.灵芝多糖肽对肝癌细胞Huh7活性、迁移和细胞凋亡的影响 [J], 黄在兴; 刘凌云; 陈华; 翁伯琦; 林占熺; 刘朋虎4.去甲斑蝥素诱导人肝癌Huh7细胞凋亡和周期阻滞的机制研究 [J], 董秀;包红5.HBX基因对人肝癌细胞系Huh7细胞增殖和迁移的影响 [J], 卫波;成扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响
核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响王桂琴;郭彩虹;孔宪涛;仲人前;李莉;张玲珍;刘涛;王红蓓【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】2000(21)8【摘要】目的 :探讨核心蛋白聚糖 (decorin)在肝纤维化形成机制中的作用。
方法 :在正常人肝细胞株 L - 0 2及大鼠肝星形细胞株 HSC- T6体外培养体系中 ,分别加入不同质量浓度(0 .0 1,5 ,10μg/ m l) decorin共培养不同时间后 ,进行细胞计数以及 3H- Td R和 3H- L eu掺入量测定。
结果 :实验组经0 .0 1μg/ m l decorin 作用 4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L- 0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R和 3H- L eu 掺入量均显著高于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。
而5 ,10μg/ m l decorin作用4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L -0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R掺入量均显著低于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。
结论 :decorin对细胞体外增殖有双重调节作用 ;【总页数】3页(P721-723)【关键词】肝纤维化;肝细胞;肝星形细胞;细胞增殖;核心蛋白聚糖【作者】王桂琴;郭彩虹;孔宪涛;仲人前;李莉;张玲珍;刘涛;王红蓓【作者单位】第二军医大学长征医院临床实验科;太原市第二人民医院;长海医院药学部【正文语种】中文【中图分类】R575.2【相关文献】1.复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞增殖细胞核抗原表达的影响 [J], 张玮;郭顺根;谢艳爽;赵海军;贾文亭;庞亦辉;戚红丹2.重组人源白细胞介素-24联合重组人源核心蛋白聚糖对人类肝细胞癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导协同效应的研究 [J], 于培霞;杨云;王桂琴3.促肝细胞生长素对体外培养成人肝细胞增殖和细胞周期的影响 [J], 王华利;赵伟;杨永峰4.肝切除患者血清对体外培养肝细胞增殖能力的影响 [J], 邢谦哲;高英堂;骆莹;王毅军;杜智5.清肝活血方对乙醇性肝纤维化大鼠肝星形细胞和肝细胞凋亡的影响 [J], 王磊;柳涛;郑培永;邢练军;季光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究
·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2012年第1期收稿日期: 2011-06-21基金项目:国家自然科学基金资助项目（30972586）,重庆市自然科学基金重点项目（CSTC,2009BA5036）作者简介:单晓亮,男,硕士,研究方向:病毒性肝炎的发病机制; E -mail:shanxiaoliang2@ 通讯作者:唐霓,女,博士,研究方向:病毒性肝炎的发病机制; E -mail:nitang809@丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究单晓亮 刘娇 陈庆美 周帆 陈林林 权会琴 唐霓（重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016）摘 要： 旨在构建稳定表达HCV 核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core 并进行初步的生物学功能研究。
利用PCR 技术扩增HCV 核心蛋白基因，通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB -3Flag 中，将重组质粒pSEB -3F -Core 和辅助质粒pAmpho 共转染Huh7细胞，经过Blasticidine 抗性筛选，建立稳定表达HCV 核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core 。
采用RT -PCR 、Western blot 鉴定Huh7-Core 细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS 、结晶紫试验观察Huh7-Core 稳定细胞株的增殖情况。
结果显示，成功构建了表达HCV 核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core 。
结晶紫、MTS 试验证实Huh7-Core 细胞较Huh7-3Flag 细胞增殖速度增快，表达HCV 核心蛋白的Huh7-Core 稳定细胞株构建成功，Core 稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度。
关键词： 丙型肝炎病毒 核心蛋白 生物学功能 稳定细胞株 细胞增殖Development of a Hepatoma Stable Cell Line ExpressingHCV Core ProteinShan Xiaoliang Liu Jiao Chen Qingmei Zhou Fan Chen Linlin Quan Huiqin Tang Ni（The Second Affiliated Hospital and the Key Laboratory of Molecular Biology of Infectious Diseases Designated by the Chinese Ministry ofEducation ，Chongqing Medical University ，Chongqing 400016）Abstract: It was to develop a hepatoma stable cell line expressing HCV core protein and to investigate the biological function of HCV core protein. HCV core genes was amplified by PCR methods, and then cloned into plasmid pSEB -3Flag by restriction enzyme digestion. Hepatoma cell line Huh7 were cotransfected with the recombinant plasmid pSEB -3Flag -Core and pAmpho. Stable cells Huh7-Core were screened with antibiotics blasticidine. HCV core gene expression was detected with RT -PCR and Western blot assay. The cell growth of stable cell line Huh7-Core was determined by MTS assay, crystal violet staining method. Results showed that Hepatoma cell lines Huh7-Core successfully express core genes, and core protein expression was verified by Western blot analysis. Cell proliferation rate of Huh7-Core was significantly accelerated, compared with Huh7 parental cells. A hepatoma stable cell line expressing HCV core protein has been successfully established. Stable overexpression of core protein sharply promoted hepatoma cells proliferation.Key words: HCV Core protein Biological function Stable cell line Cell proliferation丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染是较严重的全球公共问题之一，是导致肝硬化甚至肝癌的重要病因。
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核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：上官建营窦科峰李霄胡小军, 张福琴, 雍召生, 遆振宇【摘要】目的: 探讨核心蛋白聚糖(decorin, DCN)对HuH7细胞系体外增殖的影响及机制。
方法: 加入不同浓度(0、 25、 50、 75、 100、125、 150、 200 μg/L)的DCN培养HuH7细胞系不同时间(12、 24、48、 72 h和2周), 用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力, 流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。
结果: DCN浓度增加及作用时间延长, 细胞增殖速度减慢、活力减低, G1期细胞增多, 凋亡增加。
结论: DCN可能为一种负性调控蛋白, 可通过调节细胞周期, 抑制肝癌细胞的增殖, 促进其凋亡。
【关键词】核心蛋白聚糖; HuH7; 细胞周期; 凋亡[Abstract] AIM: To investigate the effects and mechanism of decorin( DCN) on the proliferation of HuH7 hepatoma carcinoma cell line in vitro. METHODS: Hepatoma carcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 μg/L) for different time(12, 24, 48, 72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTT and clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTS: The proliferation of HuH7 cells could be inhibited by DCN in vitro and the inhibition effect was the time and dose dependent relationship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficiently induced by DCN in a time/dose dependent manner. CONCLUSION: DCN may be a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell proliferation through inhibiting cell cycle and inducing apoptosis of cell in vitro.[Keywords]decorin; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家族中的一员, 主要由结缔组织产生, 是一种多效性分子[1]。
有许多资料表明DCN是一种抗增殖因子, 能够抑制多种细胞增殖, 极可能是一种肿瘤抑制物, 使转化的细胞和肿瘤静止[2], 这提示DCN有可能成为新的抗肿瘤药物。
本实验旨在探讨DCN对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制, 为肝癌的防治提供新的思路。
1 材料和方法1.1 材料人类肝癌细胞HuH7细胞由本实验室提供。
RPMI 1640培养基购于Gibco公司, 按说明以双蒸水溶解, 滤膜过滤除菌, 分装, -20℃冻存备用。
新生牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品, 经56℃ 30 min水浴灭活后, -20℃冻存备用。
96孔、 6孔细胞培养板为Corning Costar公司产品。
Recombinant Human Decorin(Catalog Number: 43DE)购自美国RD公司, 用PBS稀释浓度为1 000 μg/L, -20℃冻存备用。
HEPA class100 CO2孵箱为Thermo 公司产品, CKX41荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品, 流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。
1.2 方法1.2.1 细胞培养HuH7细胞培养于100 mL/L新生牛血清RPMI1640培养液中, 含 105 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素, 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2、饱和湿度。
培养的细胞均为上皮样贴壁生长, 细胞密度(0.1～1)×109/L, 每3～4 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 细胞处理取对数生长期细胞调整密度至1×109/L, 接种于96孔板, 100 μL/孔。
接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、75、 100、 150、 200 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照, 每孔设4个复孔, 分别于12、 24、48、 72 h用MTT法检测吸光度(A490值), 并绘制曲线。
取对数生长期细胞接种于6孔板, 200个细胞/孔。
接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照培养2周, 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时, 终止培养, 甲醇固定, 吉姆萨染色后计克隆数, 计算克隆率, 并绘制曲线。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡收集对数期生长的HUH7细胞, 配成单细胞悬液(1×109/L), 与浓度为0、 25、 50、 75、 100、150 μg/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗, 标本用胰蛋白酶消化成细胞悬液, 其中一份标本用PBS洗涤2次并将细胞密度调整为109/L。
首先用微量移液枪移取20 μL细胞悬液, 然后细胞悬液中加入Annexin V并避光静置15 min后, 将PI染料加入并静置30 min, 上机检测。
另一份标本加无水乙醇固定。
PBS洗涤乙醇, 取细胞悬液2 mL, 以1 500 r/min离心5 min, 弃上清, 轻轻摇动, 加入PI去污染液(含10 mL/L TritonX100)2 mL, 避光染色10 min。
流式细胞仪检测, 每份标本测定20 000个细胞, 测量速率为150～200个细胞/s。
用MultiCycle for Windows软件分析被采集资料。
1.2.4 统计学分析数据用x±s表示, 应用SPSS15.0软件包进行统计分析, 不同时间及浓度DCN对细胞增殖情况、细胞周期及凋亡率影响的比较采用SNK q检验, 检验水准取α=0.05。
2 结果2.1 DCN不同浓度及时间对HuH7细胞增殖的影响 HuH7细胞经DCN作用不同时间, 其吸光度在同一时间点随作用浓度增加而逐渐降低, 说明细胞增殖随DCN浓度增加而逐渐减弱; 同一浓度DCN作用, 随着作用时间的延长, 吸光度增加速度逐渐减慢, 说明较对照组细胞增殖活力减低(图1, P0.052.2 DCN作用浓度对HuH7细胞增殖的影响将不同浓度DCN作用HuH7细胞96 h后吸光度(A490值)结果做统计分析(表1)。
显示不同浓度DCN A值与阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05或P0.01), 表明不同浓度DCN对细胞增殖的影响不同, 且随浓度增加, 抑制效果逐渐增强。
2.3 克隆实验结果 HuH7细胞以不同浓度DCN培养2周, 出现肉眼可见克隆, 处理后计数并计算克隆率(Clone Rate), 结果显示, 随着DCN浓度增加, 细胞克隆率呈下降趋势, 这表明DCN对HuH7增殖有一定抑制作用(图2)。
表1 不同浓度DCN作用HuH7细胞96 h A值2.4 DCN对HuH7细胞周期和凋亡率的影响随着DCN浓度的增加, HuH7的G1期细胞数明显增多, S期细胞数明显减少, G2期细胞数则无明显变化规律, 同时凋亡细胞率逐渐升高 (图3、 4)。
3 讨论DCN是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖, 与肿瘤的发生、发展密切相关。
Santra等[3]将DCN cDNA稳定转染人乳腺癌MDA453细胞, 这些被成功转染的细胞克隆表现明显的生长抑制, 细胞克隆在软琼脂上不形成集落, 在scid小鼠中不形成肿瘤, 并且G1期细胞增加。
此外, Nash等[4]研究发现直接加入人DCN能够抑制卵巢癌细胞系SKOV3和2774细胞的增长, 并且与抗肿瘤药物卡铂有协同作用。
Koninger等[5]研究发现直接加入人DCN能够抑制胰腺癌细胞系的增殖, Tralh o等[6]进一步报道腺病毒介导的DCN cDNA的表达能够使肿瘤细胞在小鼠体内凋亡并且可以抑制对侧肿瘤细胞的生长, 而且这种抑制还是特异性的, 正常组织细胞却不发生凋亡和生长抑制。
本研究显示DCN可抑制体外培养HuH7细胞增殖, 流式细胞术检测G0期细胞显著增多, G1期细胞周期阻滞, G0/G1期的肿瘤细胞比率越高, 表明DCN可以延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡, 使S期和G2期细胞明显降低, 提示DCN可能影响细胞周期细胞, 使HuH7细胞多数停滞于DNA合成前期, DNA合成障碍, 使肿瘤细胞的倍增时间延长[7]。
同时本实验中经DCN作用后的HuH7细胞凋亡率显著地增高, 提示诱导凋亡亦可能是DCN抑制肝癌细胞的机制之一。
国内外有关DCN文献报道其有效工作浓度基本上都是在mg/L水平, 本实验将重组人DCN用PBS稀释成1 000 μg/L, -20℃冻存备用。
在预实验及实验时均得出理想的结果, 而且随剂量增大及时间的延长抑制效果明显增加。
在肝癌细胞体外培养小剂量DCN未见到刺激细胞增殖作用, 这可能早期国内报道DCN对正常肝细胞及肝星形细胞有双重调节作用不同, 即0.01 mg/L DCN可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖;5、 10 mg/L DCN则具有抑制细胞生长的作用, 这可能提示DCN在肝癌中的作用不同于正常肝细胞, 小剂量DCN对肝癌细胞系HuH7即有明显抑制效果可能也与其本身生长特性也有一定关系。
国外报道DCN 最高浓度用到500 mg/L, 且发现增加到一定剂量后, 细胞抑制效果不再增加[4]。