蛋白体外表达与纯化
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
体外蛋白结合实验报告
一、实验背景蛋白质与蛋白质之间的相互作用在生物体内发挥着至关重要的作用，包括信号传导、基因表达调控、细胞骨架组织等。
体外蛋白结合实验是研究蛋白质相互作用的重要手段之一。
本实验旨在研究两种蛋白质A和B之间的相互作用，并通过一系列实验验证其结合能力。
二、实验目的1. 验证蛋白质A和B在体外是否具有结合能力。
2. 确定蛋白质A和B结合的最适条件。
3. 分析影响蛋白质A和B结合的因素。
三、实验材料1. 蛋白质A和B：分别从细胞培养液中纯化获得。
2. 蛋白质标记物：荧光素标记的蛋白质A和B。
3. 试剂：缓冲液、透析袋、SDS-PAGE凝胶、电泳缓冲液、Western blot试剂等。
4. 仪器：蛋白纯化系统、紫外分光光度计、电泳仪、Western blot系统等。
四、实验方法1. 蛋白质纯化：分别从细胞培养液中纯化蛋白质A和B，并鉴定其纯度。
2. 标记蛋白质：将蛋白质A和B分别用荧光素进行标记，获得荧光标记的蛋白质A（F-A）和荧光标记的蛋白质B（F-B）。
3. 蛋白质结合实验：a. 将F-A和F-B按照一定比例混合，在不同温度和pH条件下进行反应。
b. 反应结束后，通过SDS-PAGE和Western blot检测F-A和F-B的结合情况。
4. 影响结合因素分析：a. 研究温度、pH、离子强度等因素对蛋白质A和B结合的影响。
b. 通过改变反应体系中蛋白质A和B的浓度，研究其结合能力的变化。
五、实验结果1. 蛋白质纯化：蛋白质A和B的纯度均达到95%以上。
2. 蛋白质标记：荧光标记的蛋白质A和B的标记效率分别为85%和90%。
3. 蛋白质结合实验：a. 在一定范围内，蛋白质A和B在体外可以发生结合。
b. 在不同温度和pH条件下，蛋白质A和B的结合能力有所差异。
4. 影响结合因素分析：a. 温度对蛋白质A和B的结合有一定影响，最适温度为37℃。
b. pH对蛋白质A和B的结合也有一定影响，最适pH为7.4。
c. 离子强度对蛋白质A和B的结合有显著影响，高离子强度有利于蛋白质A和B的结合。
蛋白质体外表达与进化技术
［８］ＪｏｏｂｅｕｒＴｅｔａｌ．Ｐｌａｎｔ，２００４，３９（３）：２８３—２９７［９］ＦｅｕｉｌｌｅｔＣｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（２５）：１５２５３—１５２５８［１０］ＴａｎｋｓｌｅｙＳＤｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１９９５，１１（２）：６３—６８［１１］ＳｃｈｗａｒｔｚＤＣｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，１９８４，３７：６７—７５［１２］王永军等．遗传学报，２００４，３１（１）：８７—９０［１３］杨立春等．中国农业科学，２００４，３７（１）：６５—７１［１４］ＭａｄｓｅｎＬＨｅｔａｌ．ＭｏｌＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，２６９：１５０—１６１文章编号：１０００－１３３６（２００５）０４－０３３３－０３蛋白质体外表达与进化技术王长松刘友生陈燕平１（第三军医大学西南医院病理学研究所，重庆４０００３８；１西南医院国际合作实验室，重庆４０００３８）摘要：蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和ｍＲＮＡ展示技术。
与蛋白质体内表达系统相比，体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约１０１２～１０１３左右），同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化，增加了蛋白质文库的多样性，促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。
该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。
关键词：蛋白质体外表达；核糖体展示；ｍＲＮＡ展示；进化中图分类号：Ｑ５１；Ｑ８１６———————————收稿日期：２００５－０５－１６国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０２７１３４２）作者简介：王长松（１９７２—），男，博士，主治医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｏｌｄｅｎｆｉｎｇｅｒ８５０１２４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；刘友生（１９５５—），男，博士，教授，博士生导师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｓｈｅｎｇｌｉｕ６６０＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ从２０世纪８０年代至今，产生了多种筛选肽或蛋白质文库的新技术，这些技术方法大多以表面展示来命名，如细胞表面展示、质粒展示和酵母双杂交系统等。
泛素化相关蛋白纯化及体外泛素化体系的建立
泛素化相关蛋白纯化及体外泛素化体系的建立泛素化是通过连接泛素蛋白到其他蛋白质上，参与细胞信号传导和蛋白质降解的过程。
泛素化相关蛋白的纯化以及体外泛素化体系的建立对于研究泛素化的机制和功能至关重要。
本文将探讨泛素化相关蛋白的纯化方法和体外泛素化体系的建立。
首先，泛素化相关蛋白的纯化是研究泛素化机制的基础。
泛素化相关蛋白包括泛素连接酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接靶蛋白（E3）。
这些蛋白质的纯化需要从细胞或组织中提取，并进行一系列的纯化步骤。
通常，泛素化相关蛋白的纯化以重组蛋白的形式进行。
首先，需要克隆并表达目标蛋白的基因。
可以通过基因工程技术将目标蛋白的编码序列克隆到合适的表达载体中，如原核表达系统（如大肠杆菌）或真核表达系统（如酵母或哺乳动物细胞）。
表达载体通常包含启动子和转录终止子，可以使目标蛋白在宿主细胞中高效表达。
之后，选择合适的培养条件和诱导剂使目标蛋白表达。
培养细胞并收获细胞，利用超声波或高压法破裂细胞膜释放蛋白质，得到总细胞提取物（whole cell lysate）。
细胞提取物中含有目标蛋白以及其他蛋白质和细胞器。
可以利用柱层析技术将目标蛋白与其他蛋白质分离。
常用的柱层析方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。
亲和层析是通过目标蛋白与柱子上的亲和基团的特异性结合来实现分离，如亲和树脂与目标蛋白之间的亲和相互作用。
常见的亲和层析方法包括金属螯合层析和抗体亲和层析。
离子交换层析是利用蛋白质与带电基团之间的静电吸引力进行分离。
根据蛋白质的电荷，可以选择合适的离子交换柱。
凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大的蛋白质无法通过凝胶颗粒的孔隙而留在柱子中，而较小的蛋白质可以通过。
通过柱层析分离纯化后，可以进行进一步的纯化和检验，如SDS-PAGE和Western blot。
这些步骤可以用于确定目标蛋白的纯度和存在形式。
在泛素化相关蛋白纯化之后，可以进一步建立体外泛素化体系来研究泛素化的机制和功能。
重组蛋白分离纯化的方法策略及案例介绍
肽配体结合为基础。同时，带有 GST 的蛋白与配体结合是可逆的，能够在温和，非变性的条件下通过加入还原型 谷胱甘肽被洗脱下来。
材料 BL21 感受态细胞 PGEX 表达载体 LB 培养基 Amp（氨苄青霉素） IPTG 蛋白酶抑制剂 缓冲液 1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl） 缓冲液 2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl） PBS 缓冲液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4） 洗脱缓冲液（50mmol/L Tris，PH 8.0,10mmol/L GSH） 微量紫外分光光度计 超声波破碎仪 高速冷冻离心机 GST 柱
由上表可知选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可避免破碎细胞的步骤，而且细胞外和周质空间内的 蛋白种类较少，目的蛋白易纯化；而在细胞质内表达重组蛋白时，重组蛋白通常是可溶性表达，但也易形成包涵体。 可溶性蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离且纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白质却变得相当困 难，通常需要对聚集的蛋白进行变，复性，而通常情况下活性蛋白的得率比较低。德泰生物凭借多年的蛋白表达服 务操作经验和相关的技术，可以提供可溶性重组蛋白保证型服务和更高纯度的上清蛋白。
分离纯化原则总结： 1 应尽可能利用蛋白质不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同技术多次纯化； 2 不同的蛋白在性质上有很大区别，每一步纯化步骤都应当充分利用目的蛋白和杂质成分物理性质差异； 3 在纯化早期阶段要尽量减少处理体积，方便后续纯化； 4 在纯化后期阶段，再使用造价高的纯化方法，有利于纯化材料的重复使用，减少再生复杂性。
大肠杆菌裂解液 体外蛋白表达
大肠杆菌裂解液是一种重要的生物工程工具，被广泛应用于体外蛋白表达和纯化领域。
本文将对大肠杆菌裂解液的主要特点和应用进行介绍，并探讨其在体外蛋白表达中的作用和影响。
一、大肠杆菌裂解液的主要特点1. 细胞壁破裂效果显著大肠杆菌裂解液具有高效破裂细胞壁的特点，能够有效释放细胞内的蛋白质和其他生物大分子。
2. 蛋白质保护能力强裂解液中含有丰富的蛋白酶抑制剂，能够有效保护被释放的蛋白质不受降解，有利于后续的纯化和分析。
3. 对细胞内组分影响小裂解液中的成分对细胞内其他生物分子的影响较小，不会对后续实验结果造成干扰。
二、大肠杆菌裂解液在体外蛋白表达中的作用1. 促进目的蛋白质的释放在体外蛋白表达中，通过添加大肠杆菌裂解液可以有效促进目的蛋白质的释放，提高表达效率。
2. 保护蛋白质不受降解裂解液中的蛋白酶抑制剂能够保护被释放的蛋白质不受降解，保证表达蛋白的稳定性和纯度。
3. 降低后续纯化的复杂性大肠杆菌裂解液中的成分对后续蛋白质纯化的影响较小，能够降低纯化过程的复杂性，提高纯化效率。
三、大肠杆菌裂解液的应用1. 体外蛋白表达和纯化大肠杆菌裂解液是最常用的细胞裂解方法之一，在体外蛋白表达和纯化过程中发挥着重要作用。
2. 药物开发在药物开发过程中，大肠杆菌裂解液可用于表达和纯化功能性蛋白，为药物研发提供重要的支持。
3. 生物工程研究在生物工程领域，大肠杆菌裂解液也被广泛应用于蛋白质的功能研究和分析。
四、大肠杆菌裂解液的影响因素1. 裂解液成分裂解液中不同的成分对目的蛋白质的释放和稳定性有影响，需要根据具体实验要求选择合适的裂解液。
2. 裂解条件裂解的温度、时间和压力等条件会影响裂解效果，需要进行优化以达到最佳表达效果。
3. 后续处理裂解后的样品需要适当的后续处理，比如清除细胞残渣、沉淀蛋白质等，以保证后续实验的准确性和可靠性。
大肠杆菌裂解液作为一种重要的生物工程工具，在体外蛋白表达和纯化中发挥着重要的作用，具有很高的应用价值。
蛋白质的体外合成和纯化作业
蛋白质的体外合成和纯化一、蛋白质体外合成方法概述无细胞蛋白质合成系统（The cell-free protein synthesis system）是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。
与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白质，能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究。
基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。
其中，“分”是指分离制备合格的待进一步操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出的目的基因；“连”是指用DNA连接酶，将目的DNA 同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内的目的基因被大量的复制。
基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
二、基因克隆方法操作步骤1、目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。
获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步，基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段。
所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。
常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选。
2、重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA 上，以便下一步转化之用。
基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略研究
基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略研究随着生物技术的高速发展和生物学研究的深入，对于蛋白表达和纯化的需求也越来越大。
其中，生物素化技术作为一种快速、高效、灵敏的标记技术，正受到越来越多的关注和研究。
本文将重点介绍基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略。
第一部分：生物素化技术的基础原理生物素是一种水溶性维生素，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中，是一种重要的共生信号分子。
生物素化技术即利用生物素和生物素结合蛋白(Biotin-binding protein, BBP)之间的高亲和力，并通过干扰生物素与其它蛋白质的结合来标记和纯化感兴趣的蛋白或酶。
生物素化技术还可以分为两种：一种是利用菌体表达S tagging的生物素化技术(Biotin tag)，另一种是利用体外生物素化技术(Biotinylation)。
前者是将生物素连接到蛋白N端或C端附近，后者则是在蛋白N端或C端附近引入一个生物素化底物，随后加入生物素化酶引入生物素，从而实现蛋白标记和纯化。
第二部分：基于生物素化技术的蛋白表达策略1. 菌体表达生物素标记蛋白(Biotin tag)菌体表达生物素标记蛋白(Biotin tag)是基于遗传工程的方法，将BBP结构域融合到目标蛋白的N、C端，在表达和纯化过程中即可利用高亲和力进行标记和纯化。
优点：操作简单、标记和纯化效率高、纯度高。
缺点：蛋白质结构和生物活性可能会受到BBP的融合影响。
2. 利用体外生物素化技术(Biotinylation)表达蛋白利用体外生物素化技术，首先在蛋白的表达载体中引入生物素化底物(Biotin acceptor peptide, BAP)，随后在表达过程中加入生物素化酶，即可引入生物素，实现蛋白的标记和纯化。
优点：BBP与蛋白质结合灵活，不影响蛋白结构和生物活性。
缺点：操作复杂，标记和纯化效率可能会受到底物和酶浓度的影响。
第三部分：基于生物素化技术的蛋白纯化策略基于生物素化技术的蛋白纯化策略包括干扰生物素与其它蛋白质的结合、利用高亲和力纯化带标记蛋白和对标记蛋白进行洗脱的操作步骤。
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蛋白体外表达与纯化
随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。
蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。
蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
一：原核表达系统
原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。
该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。
其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。
二：真核表达系统
真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。
因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。
作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。
三：哺乳动物细胞表达系统
由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。
表达载体的种类及相应的分离纯化方法
作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。
在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。
用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。
PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。
本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。
实验方法与步骤：
一：目的蛋白的粗提
1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞
2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
4．向上述菌液中加入0.1-0.2 mM的IPTG，15℃ 150rpm摇培20小时。
5．菌摇好后于4600 g 4℃离心15分钟集菌
6．倒掉上清，用PA缓冲液悬浮沉淀
7．在第5步条件下离心，用PB缓冲液悬浮沉淀
8．向上述菌液中按0.8mg溶菌酶/g菌体加入溶菌酶，室温下放置10分钟，并轻轻摇动9．12100g 4℃离心 20分钟，吸上清
10.向上步所得上清液中缓缓加入终浓度25%的(NH4)2SO4,此步在磁力搅拌器作用下进行，保持在0℃下进行，搅拌40分钟，静置2小时以上
11.将上步蛋白溶液在第9步条件下离心，吸上清
12．按第10步的方法向上步蛋白溶液中加入终浓度45%的(NH4)2SO4,静置5小时
13．在第9步条件下离心，倒掉上清
14．将上步所得沉淀溶于适量PBS中，装入透析袋中于PBS溶液中透析过夜
15．将透析后的蛋白溶液用PEG8000处理，至剩余2-3 ml
16．将上步所得蛋白溶液上柱（Glutathione Sepharose 4B）,如果需要的话先将蛋白溶液过滤（直径45um）滤膜再上柱
二：目标蛋白的纯化
1．取处理好的1.33 ml Glutathione Sepharose 4B悬浮液于合适试管或离心管中
2．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
3．加1 ml 4℃PBS于试管或离心管中，形成50%的Glutathione Sepharose 4B匀浆
4．将样品加入50%的Glutathione Sepharose 4B中，同时加1%TritonX---100
5．室温条件下温育20分钟，并轻轻搅动或吸吐
6．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
7．用10倍胶体积的4℃的PBS洗胶
8．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
9．将第7、8两步重复3次
10.洗脱，按每胶体积加 1 ml洗脱液（10 mM reduced glutathione in 50 mM Tris—cl,ph=8.0）
11.20--25℃温育10分钟
12．500 g 4℃，离心5分钟，吸上清
13．将10-12步重复3 次
14．将所吸上清加50%甘油-20℃保存
15．取适量纯化的蛋白溶液进行SDS—PAGE，鉴定纯化效果
蛋白体外表达与纯化的意义
1．对目标蛋白的生化特性进行研究。
2．制备目标蛋白的抗血清。
附录：缓冲液的配置
PA：0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.3M NaCl
PB:1mM DTT
0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.1mM EDTA(pH=8.0)
0.3M NaCl
2-Me (现用现加)
Tween-20
NP-40
50mM PMSF(现用现加)
PBS: 140mM NaCl
2.7mM KCl
10mM Na2HPO4
1.8mM KH2PO4。