基因定点突变 (1)
基因定点突变
基因定点突变基因定点突变是基因功能研究的重要手段之一，本文将从引入突变碱基、缺失突变、插入突变、错位突变、置换突变、无义突变、同义突变、抑制突变等方面，详细介绍基因定点突变的方法及意义。
1.引入突变碱基引入突变碱基是基因定点突变的一种常见方法，通过在特定位置插入或替换一个或多个碱基，以达到研究基因表达和功能的目的。
在引入突变碱基前，需要了解野生型DNA序列和突变DNA序列的差异以及可能的突变类型。
常见的引入突变碱基的方法包括寡核苷酸介导的基因定点诱变和PCR扩增后直接诱变。
这些方法能够有效地在基因组中引入所需突变，为研究基因表达和功能奠定基础。
2.缺失突变缺失突变是指在基因组中缺失一个或多个碱基对的突变类型。
这种突变通常会导致基因表达的下降甚至丧失，进而影响生物体的表型。
通过缺失突变研究基因功能的方法是敲除技术，即利用特异性核酸内切酶将目标基因的一部分切除。
敲除技术可以有效地用于研究基因组中非必需区的功能以及筛选基因敲除小鼠模型等。
3.插入突变插入突变是指在基因组中插入一个或多个碱基对的突变类型。
插入突变的后果取决于插入的序列和位置。
在基因组中插入外源序列可能导致基因表达的改变或产生新的表型。
插入突变通常通过同源重组或非同源末端连接实现。
利用插入突变可以研究基因的增强子、启动子等调控元件的功能以及研究转录因子结合位点等。
4.错位突变错位突变是指DNA序列中碱基对的相对位置发生改变的突变类型。
错位突变可能会导致基因表达的下降或丧失，但也可能产生新的表型。
错位突变的产生通常通过特定的核酸内切酶和连接酶实现。
利用错位突变可以研究DNA复制、修复和重组等方面的机制，同时也可以用于构建人工染色体等。
5.置换突变置换突变是指DNA序列中两个或多个不同碱基对之间的替换产生的突变类型。
置换突变可能会导致基因表达的改变或产生新的表型。
与缺失和插入突变相比，置换突变的后果可能更加复杂和微妙。
利用置换突变可以研究不同氨基酸之间的替换对蛋白质结构和功能的影响，从而深入了解基因表达和调控的机制。
热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)
得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术 （1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不 能互补的突变位点，而这两条引物有部 分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引 物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完 整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到 含有突变位点的DNA片段。
①首先人工合成一段含有特定突变位
点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，
该片段的其他部分可以与目的基因互补
配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的
基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生
而来）进行杂交；
M13噬菌体是一种丝状噬菌体， 内有一个环状单链DNA分子
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作
用下分别进行DNA链的合成和连接反应，
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基构因建，改有良的基质因粒组为质空粒白时质破粒坏，了将含上 述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培L养ac一Z基段因时(间因后)，，含再该将质菌粒液的涂大布肠在含 氨苄青霉素和__β__-_半__乳__糖__苷___的平板上。一段时间后杆，菌在不培能养分基解上β出-现半白乳色糖和苷蓝产色生两蓝种 菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是__色__物__质__（_。变），菌落为白色（果）
二轮微专题— 基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
• 【情境原理】 • 1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治
基因定点突变名词解释
基因定点突变名词解释嘿，咱今儿来唠唠基因定点突变这档子事儿！你说基因就像是生命的密码本，那基因定点突变呢，就好比是给这个密码本来了个精准的修改。
咱就打个比方哈，好比一个大机器，基因就是让这个机器运转的各种零件和程序。
那基因定点突变呢，就是咱专门挑出其中一个小零件或者一小段程序，给它变一变。
这一变可不得了，可能整个机器的运行状态就不一样啦！想象一下，本来一个生物有着特定的性状，就像一只兔子一直是白色的。
但通过基因定点突变，嘿，说不定这兔子就能变成灰色的或者其他颜色啦！这多神奇呀！基因定点突变可不是随便乱改的哦，这得非常精细、非常小心才行。
就跟咱修钟表似的，得用特别小的工具，特别仔细地去摆弄那些小零件。
一个不小心，可能整个钟表就不走了，或者走得不准啦！它的作用可大着呢！可以用来研究基因的功能呀。
咱想知道某个基因到底是干啥用的，那就给它变一变，看看生物会有啥变化，不就清楚啦？而且在医学上也很重要呢！比如说有些疾病是因为基因出了问题，那咱通过基因定点突变，说不定就能找到治疗的办法呢。
在农业上也有用武之地呀！可以让农作物变得更抗病虫害，产量更高。
这就像是给农作物来了个超级进化，让它们变得更强壮、更厉害！不过呢，这事儿也不是那么容易的。
就像走钢丝一样，得稳稳当当的，稍有偏差可能就会出大乱子。
而且也不是说变了就一定能达到咱想要的效果，有时候可能会有意想不到的结果哦。
那怎么实现基因定点突变呢？这就得靠那些厉害的科学家们啦！他们有各种高科技的手段和工具，就像孙悟空有金箍棒一样，能把基因这个“妖怪”给制服咯！总之呢，基因定点突变是个很有意思、很有挑战性的领域。
它就像是打开生命奥秘大门的一把钥匙，让我们能更深入地了解生命的奇妙之处。
咱可得好好研究研究，说不定哪天就能给我们的生活带来翻天覆地的大变化呢！可不是嘛！。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是一种用于改变特定基因序列的方法。
它可以被用于研究基因功能，以及开发新的基因治疗方法。
基因定点突变技术的原理是利用特定的酶切位点或特异性识别序列，将新的DNA序列插入到目标基因中。
这种技术通常使用质粒或病毒载体来将新的DNA序列导入目标
基因中，然后使用细胞转染或转化的方法将质粒或病毒载体导入细胞中，从而实现对目标基因的改变。
基因定点突变技术不仅可以用于改变单个基因的序列，还可以被用于删除或插入多个基因。
这种技术的应用非常广泛，包括基因治疗、基因工程以及基因组学研究等领域。
但是基因定点突变技术也存在一些挑战，包括技术成本高、效率低、难以操作等问题。
因此，不同的实验室和公司都在开发新的基因定点突变技术，以突破这些技术难关。
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基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略基因定点突变是指基因序列中的一些碱基发生了改变，可以是单个碱基的替换、插入或删除。
这种突变一般发生在DNA的编码区域，会导致蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。
基因定点突变在许多遗传病和疾病中起着重要的作用。
以下是关于基因定点突变的全攻略。
1.基因定点突变的类型基因定点突变可以分为三类：错义突变、无义突变和非义突变。
错义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，从而使蛋白质的氨基酸序列发生了改变。
无义突变是指被改变的碱基导致了密码子的提前终止，从而使蛋白质的合成过早终止。
非义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，但不会改变蛋白质的合成。
2.基因定点突变的起因基因定点突变可以由多种因素引起，如自然突变、致突变剂和辐射。
自然突变是指在正常细胞分裂和DNA复制过程中产生的突变。
致突变剂是指能够引起DNA突变的化学物质或物理因素，如化学药物、辐射等。
辐射包括离子辐射和非离子辐射，如X射线、紫外线等。
3.检测和诊断基因定点突变检测和诊断基因定点突变可以通过分子生物学技术进行，如PCR、DNA测序和核酸杂交等。
PCR可以扩增特定的DNA片段，从而使突变的碱基更容易被检测到。
DNA测序可以确定基因序列的每个碱基，从而找到突变的位置和类型。
核酸杂交可以通过与已知突变序列杂交，检测是否存在突变。
4.基因定点突变的遗传5.基因定点突变与疾病总结：基因定点突变是基因序列中的一些碱基发生改变，影响蛋白质的功能。
基因定点突变可以分为错义突变、无义突变和非义突变。
突变的原因包括自然突变、致突变剂和辐射。
基因定点突变的检测和诊断可以通过分子生物学技术进行。
基因定点突变可以遗传给后代，影响他们的生长和发育。
基因定点突变在许多疾病中起着重要作用，了解基因突变对于早期诊断和治疗具有重要意义。
基因定点突变
PCR介导的定点突变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
盒式诱变
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
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基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC 含量为40%，L 为30，将这两个数值带入Tm 值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
通过计算可以看出其Tm 低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。
（3）重新调整引物长度。
Primer #1: 5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG -3’
Primer #2: 5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG -3’
在引物两端加5mer （斜体下划线处），这样引物的GC 含量为45.7%，L 值为35，将这两个数值带入Tm 值计算公式，得到其Tm 为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR 喽，不过对于PCR 的酶和buffer ，不能用平时的，我们做PCR 把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K ，所以要用那些GC buffer 或扩增长片段的buffer ，另外，要用保真性能较好的PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq 酶、Takara 的PrimeSTAR HS DNA polymerase TM 。
六、如何去掉PCR 产物
最简单的方法就是用DpnI 酶，DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR 产物都是没有甲基化的，所以DpnI 酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR 产物，从而去掉模板留下PCR 产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI 处理的PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。
1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
2. 准备模板质粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μl
Control primer mix（20pmol/μl）2μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
4. 样品反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl）1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl）1μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
5. PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃30sec
15cycle 95℃ 30sec 55℃ 1min
72℃1min per plasmid Kb
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降
低的现象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles [B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。
因此我们建议为了保证突
变率请严格遵照实验步骤进行操作。
如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌
株，例如DH5α。
1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。
2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。