定点突变技术——从单点突变到多点突变
定点诱变技术
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但 在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基 因组DNA中将含有20-30个尿 嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法
定点突变技术的原理和步骤
定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。
那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。
这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。
这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。
那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。
首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。
然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。
接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。
把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。
这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。
这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。
你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。
比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。
在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。
想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。
它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。
我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。
你说是不是呀？。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
定点突变技术：从单点突变到多点突变
定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E. coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经da m甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
简单介绍定点单突变与多突变
1.3.克隆及测序：反应结束后,将PCR 产物进行回收,经
酶切、连接、转化等步骤后克隆到pGL3 - Basic报告基因载 体中,送上海生物工程公司测序。看单位点突变是否成功。
结果：
重叠延伸PCR扩增人TGF -β2基因启动子 区-114bp区突变基因 Ⅰ和Ⅱ分别为5’端带有突变位 点的短片段PCR产物, Ⅲ是以Ⅰ和Ⅱ为模板进行延伸 并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物,见图1。
2.定点多突变：下面举一个双突变的例子：与单突
变不同，双突变需要六个引物，两个通用引物，以及四个定点 突变引物：方法看图2.
结果：
图2 各阶段PCRБайду номын сангаас物电泳图
M:DL2000 DNA 分子量标记; 1: 985bp 片段; 2: 578bp 片段; 3: uORF1Mu (由985bp 片段、578bp 片段重叠延伸而来,长 1534bp) ; 4: 1101bp 片段; 5: 459bp 片段; 6: uORF2Mu (由1101bp 片段、459bp片段重叠延伸而来,长1534bp)
一：定点单突变
1 材料和方法 1.1.材料：Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、 T4DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖。2 个含有突变碱基的反向互补的引物，2个分别与DNA两端互 补的上下游通用引物：
引物1:5’GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3’， 引物2: 5’GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3’， 引物3: 5 ’ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3 ’， 引物4:5’GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3’，
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
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定点突变技术——从单点突变到多点突变
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli
中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。
另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。
试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。
只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。
这个试剂盒适用于质粒大小不超过
8Kb的质粒。
后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质
粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。
QuikChange由于操作简单快速，效率高（>80%）而受到普遍欢迎，光是今年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。
定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物（同一方向，对同一单链模版），一条包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点，不过在单酶切位点中引入突变，这样两条引物除了所包含的突变位点，其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致，退火后和质粒模版结合，通过T4 DNA聚合酶延伸，延伸反应持续直到碰到另一条引物停止，两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环，和模版链组成杂和环，带有两处错配。
单酶切反应产物，直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。
原来的双链质粒模版被切开而不能转化，而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，保持环状质粒得以转化。
转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，最后得到纯和的突变质粒。
这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。
虽然这个试剂盒比上一个麻烦，但实际上是引入了两个定点突变。
只不过一个用于酶切除掉模版的反应。
有的时候研究可能需要多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。
因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。
最多一次实验可以引入5个定点突变。
这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同定点突变的质粒（因为存在1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。
不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。
不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。
定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。
由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。