功能蛋白质组学研究方法课件
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功能蛋白质组学研究方法ppt课件
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• 该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一 个整体起作用。
• 分别经分子克隆技术在同一细胞中表达的BD和 AD多肽不会彼此间发生作用，BD和AD分别可以 同其他蛋白质X或Y结合形成融合蛋白,如果X，Y 之间可以形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构 域重新构成AD和BD成为一体,就可以启动特异基 因序列的转录。
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SELDI-TOF-MS蛋白质芯片
表面加 强激 光 解 吸电 离 - 飞行 时间 质谱 (surface
enhanced laser desorption /ionization time of
flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS ）蛋白质 芯片由３部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析 软件。 蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以 是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等， 根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的 蛋白质。
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酵母双杂交系统的局限性
1.并非对所有蛋白质都适用
双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于核内,而 许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工,如糖基 化,二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外, 有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋 白的辅助,这限制了某些细胞核外蛋白和细胞膜受 体蛋白等的研究。
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抗体芯片
抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质 水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重 要特点。
芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些 单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能 上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调 控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。
相互作用蛋白质组学ppt课件
相互作用蛋白质组学
1
• 蛋白质是生命过程的真正执行者，蛋白质相互作 用与生命健康息息相关。因此，蛋白质互作研究 也是基础生命科学的一个重点研究领域.
• 生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和 调节。其中，多数蛋白质是通过与配体结合或是 作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过 程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命 活动的基础。
1. 基本概述 2. 基本过程 3. 应用与优缺点
4
基本概述
• 酵母双杂交系统( Yeast two-hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步 建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质。
• 该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4，含有的两个结构域，DNA结合域 (DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD)，将已知基因 （诱饵基因）和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上，将两种质粒共同 转化酵母感受态细胞，若B此间结合时，则会导致位于侧翼的 BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，激活下游的报告基 因表达，从而在特定的选择性培养基上生长。
1. 基本概述 2. 基本过程 3. 优缺点
14
基本概述
• 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗体和抗原之间的专 一性作用为基础的、用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
• 原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白 质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫 沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；
12
缺点
1. 分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的 相互作用依赖于翻译后加工，如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行；
1
• 蛋白质是生命过程的真正执行者，蛋白质相互作 用与生命健康息息相关。因此，蛋白质互作研究 也是基础生命科学的一个重点研究领域.
• 生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和 调节。其中，多数蛋白质是通过与配体结合或是 作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过 程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命 活动的基础。
1. 基本概述 2. 基本过程 3. 应用与优缺点
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基本概述
• 酵母双杂交系统( Yeast two-hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步 建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质。
• 该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4，含有的两个结构域，DNA结合域 (DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD)，将已知基因 （诱饵基因）和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上，将两种质粒共同 转化酵母感受态细胞，若B此间结合时，则会导致位于侧翼的 BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，激活下游的报告基 因表达，从而在特定的选择性培养基上生长。
1. 基本概述 2. 基本过程 3. 优缺点
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基本概述
• 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗体和抗原之间的专 一性作用为基础的、用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
• 原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白 质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫 沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；
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缺点
1. 分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的 相互作用依赖于翻译后加工，如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行；
植物蛋白质组学ppt课件
3.4.1 蛋白质组数据库
蛋白质组包括大量的信息：蛋白质的序列信息、加工和修饰信息、表达 结构功能信息、与其他蛋白质形成复合物的信息。
蛋白质 数据库
拟南芥数据库 拟南芥蛋白数据库PAT 苜蓿数据库DOME
3.4.2 蛋白质鉴定分析软件
例如 ：2-DE成像分析软件：Melanie ,QUEST 蛋白质鉴定软件：MASCOT ,PROWL
（2）基因组的组成是固定的，蛋白质组的组成是动态的。 基因组在所有细胞中几乎都是相同的，与之不同，蛋白质组具有 很高的细胞和组织特异性。 基因组是相对稳定的，蛋白质组处于高度动态变化之中。
（3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105）。
（4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有这些技术。
蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利 用各种先进技术研究蛋白质表达的整体变化,即研究在机体的生长发 育、疾病和死亡的不同阶段中,细胞与组织的蛋白质组分的变化;后者 主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用
2.蛋白质组和基因组
蛋白质组和基因组的关系：它们在概念上有相关性，代表某一蛋白
5. 植物蛋白质组学研究的前景和挑战
植物蛋白质组学的研究与应用面临3个主要问题： 1.表达的整体分析以及蛋白质组编目
大规模整体性的分析蛋白质在某一个细胞或组织中的含量以及动 态表达是蛋白质组学的研究目标之一。 2.大规模的蛋白质功能研究 蛋白质最大的挑战是鉴定每一个蛋白质以及它们的异构体的功能， 一个较有前景的策略是通过酵母双杂交系统整体性研究植物蛋白 质之间的相互作用。 3.建立完整的蛋白质调控网络 建立蛋白质调控网，不仅可以提供蛋白质之间的相互关系的信息， 而且还可以和基因组学、转录组学、代谢组学等信息联系起来。
《蛋白质组研究技术》课件
纯化得到相互作用蛋白。
酵母双杂交技术
利用酵母细胞表达的蛋白与待测蛋白 进行相互作用，筛选出与待测蛋白相 互作用的蛋白。
串联亲和纯化技术
将待测蛋白与其相互作用蛋白一起纯 化下来，再通过分离纯化得到相互作 用蛋白。
03 蛋白质组学在生物医学中 的应用
疾病标志物发现
疾病诊断
通过蛋白质组学技术，发现与疾病相关的特异性蛋白质标志物，有助于疾病的早 期诊断和预后评估。
电泳技术
利用蛋白质在电场中的迁移率不同，将蛋白质分 离成不同的条带。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片上，通过与待测蛋白质的相 互作用，实现对蛋白质的筛选和检测。
蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定技术
利用各种技术手段对分离得到的蛋白 质进行鉴定，确定其氨基酸序列和分 子量等信息。
氨基酸序列分析
通过测定蛋白质中氨基酸的排列顺序 ，确定蛋白质的种类和来源。
未来发展趋势与展望
技术创新
未来蛋白质组学技术将继续创新 ，如高通量、高灵敏度、高分辨 率的蛋白质检测技术。
跨学科融合
蛋白质组学将与生物信息学、计 算生物学等学科进一步融合，实 现多维度、多层次的数据分析。
临床应用拓展
随着技术的进步和应用研究的深 入，蛋白质组学将在临床诊断、 治疗和药物研发等方面发挥更大 的作用。
分子量测定
利用质谱等技术手段测定蛋白质的分 子量，以验证蛋白质鉴定的准确性。
免疫学检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和 识别，具有高灵敏度和特异性。
蛋白质功能研究技术
蛋白质功能研究技术
通过各种手段研究蛋白质在生物体内的功能 和作用机制。
细胞生物学技术
通过观察蛋白质在细胞内的定位、分布和动 态变化，研究其功能和作用机制。
酵母双杂交技术
利用酵母细胞表达的蛋白与待测蛋白 进行相互作用，筛选出与待测蛋白相 互作用的蛋白。
串联亲和纯化技术
将待测蛋白与其相互作用蛋白一起纯 化下来，再通过分离纯化得到相互作 用蛋白。
03 蛋白质组学在生物医学中 的应用
疾病标志物发现
疾病诊断
通过蛋白质组学技术，发现与疾病相关的特异性蛋白质标志物，有助于疾病的早 期诊断和预后评估。
电泳技术
利用蛋白质在电场中的迁移率不同，将蛋白质分 离成不同的条带。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片上，通过与待测蛋白质的相 互作用，实现对蛋白质的筛选和检测。
蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定技术
利用各种技术手段对分离得到的蛋白 质进行鉴定，确定其氨基酸序列和分 子量等信息。
氨基酸序列分析
通过测定蛋白质中氨基酸的排列顺序 ，确定蛋白质的种类和来源。
未来发展趋势与展望
技术创新
未来蛋白质组学技术将继续创新 ，如高通量、高灵敏度、高分辨 率的蛋白质检测技术。
跨学科融合
蛋白质组学将与生物信息学、计 算生物学等学科进一步融合，实 现多维度、多层次的数据分析。
临床应用拓展
随着技术的进步和应用研究的深 入，蛋白质组学将在临床诊断、 治疗和药物研发等方面发挥更大 的作用。
分子量测定
利用质谱等技术手段测定蛋白质的分 子量，以验证蛋白质鉴定的准确性。
免疫学检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和 识别，具有高灵敏度和特异性。
蛋白质功能研究技术
蛋白质功能研究技术
通过各种手段研究蛋白质在生物体内的功能 和作用机制。
细胞生物学技术
通过观察蛋白质在细胞内的定位、分布和动 态变化，研究其功能和作用机制。
蛋白质组学的研究方法和进展
2021/10/6
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样品预分级的主要依据
蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶
绿体等
2021/10/6
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组织水平蛋白质组样品制备
原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂， 而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞 总是与血管、基质细胞等混杂。
2021/10/6
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科技部已将疾病蛋白质组研究列入我 国“973”计划项目和“863”计划项目； 国家自然科学基金委员会也将“蛋白质 组研究”列为重点项目。
我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌 蛋白质组研究方面取得了较大进展。
2021/10/6
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第二节 蛋白质组学研究方法概述
2021/10/6
H3 High-grade
Apoliprotein A-I (H4) H4 H4
40 Low-grade
40 High-grade
Peroxiredoxin 6 (H5)
13 48
H5 Low-grade
13 48
H5 High-grade
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二维电泳优点
可分离10～100 kD 范围内蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 可以精确设定pH梯度。
尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析， 大大提高了分辨率及重复性。
2021/10/6
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第二向SDS-PAGE电泳
双向凝胶垂直电泳 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二
维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的 差异，垂直方向反映分子量上的差别。
2021/10/6
蛋白质组学-PPT课件
iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
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2：蛋白质组学研究内容
2.1：蛋白质的表达模式 （1）生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库。 （2）蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定。 2.2：蛋白质的功能模式 （1）蛋白质结构分析。 （2）蛋白之间相互作用，翻译后修饰，细胞定位等。
3: 化学标记法—iTRAQ
简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
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蛋白质组学Proteomics-PPT课件.ppt
ICAT的优点
• ICAT具有广泛的兼容性，主要表现在：(1) 能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组 织中绝大部分蛋白质；(2)烷化反应即使在 盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸 胍等)存在下都可进行；(3)只需分析含Cys 残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分 析的复杂性；(4)ICAT战略允许任何类型的 生化、免疫、物理的分离方法，因此能很 好地定量分析微量蛋白质。
双向凝胶电泳
• 首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的 蛋白，再利用SDS－PAGE来分离不同分子 量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级 的蛋白质就可以被很好的分辨开了。
基质辅助的激光解吸电离技术
（MALDI）的发展
• 日本岛津公司的田中耕一的工作，是质谱分析发 展的一个主动力。 1987年，在第二届中－日质谱 分析联合讨论会上，田中耕一论述了软激光解吸 附技术可以使蛋白质分子离子化。一年之后，他 的这篇创造性的论文发表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中 耕一的工作为基质辅助的激光解吸电离技术 （Maldi）打下了基础。2019年，他和弗吉尼亚联 邦大学的John B Fenn，由于他们对软吸附电离 方法上的贡献一起被授予了该年度诺贝尔化学奖
应用实例
• 1.通过比较给药前后细胞的蛋白质组, 鉴别出毒理学的蛋白质标志物 。
• 2. 疟疾疫苗的研究。
ICAT技术
同位素标记的亲和标签（isotope-coded affinity tag， ICAT）技术作为一种体外标记稳定同位素的相对定量方法， 已经成为重要的蛋白质组学定量分析方案。2019年，Gygi 等人用化学方法合成一种能和半胱氨酸反应的亲和试剂， 称为稳定同位素编码的亲和标签，它有轻链和重链(稳定重 同位素)两种形式，可以在体外标记不同状态下的蛋白质样 品，酶解并用亲和柱分离纯化被标记的肽段后，再用质谱 进行分析，和体内标记法一样也能够得到成对的峰表示不 同样品中肽段及对应蛋白质含量的差异。这种稳定同位素 亲和标签技术可以广泛地应用在细胞和组织的定量蛋白质 组学分析上，提供精确的蛋白质相对定量数据。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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