免疫比浊法和免疫投射比浊法(修改版)
mian对比研究免疫透射比浊法及免疫散射比浊法在血清免疫球蛋白检测中的应用效果
mian对比研究免疫透射比浊法及免疫散射比浊法在血清免疫球蛋白检测中的应用效果【摘要】目的：对比应用免疫散射比浊法、免疫透射比浊法实施血清免疫球蛋白检测的效果。
方法：应用透射比浊法、散射比浊法对2013年5月-2014年9月期间在我院接受健康体检的82例健康人员进行血清免疫球蛋白检测，并对2种方法的检测结果进行比较分析。
结果：2组方法的检测结果较为相似，比较未存在显著性（P＞0.05）。
结论：使用透射比浊法、散射比浊法对患者实施血清免疫球蛋白检测均可取到相似的检测结果，但是免疫透射比浊法具有更好的精密度，检测误差更小。
【关键词】散射比浊法；免疫球蛋白；免疫球蛋白【中图分类号】R446.62 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）9-0671-02血清免疫球蛋白（Ig）为人体内极为重要的免疫蛋白，因此通过对血清免疫球蛋白进行检测可为人体免疫功能评定提高可靠参考依据[1]。
目前，临床上主要应用的血清免疫球蛋白检测方法主要有两种，分别为透射比浊法和散射比浊法。
本次研究主要对比该2中检测方法在临床应用中的效果，现将研究结果报告如下。
1 资料与方法1.1一般资料选择2013年5月-2014年9月期间在我院接受健康体检的82例健康人员作为研究对象，分别应用免疫透射比浊法、免疫散射比浊法对患者实施血清免疫球蛋白检测。
性别：男性49例，女性33例；年龄：最小为19岁，最大为75岁，平均年龄（37.1±2.8）岁。
1.2方法在研究过程中，分别应用免疫散射比浊法、免疫透射比浊法对82位研究对象的血清免疫球蛋白A、血清免疫球蛋白G、血清免疫球蛋白M进行常规性检测。
然后再使用该两种方法对研究对象的免疫球蛋白G进行精确检测。
本次研究的具体检测操作表现如下：在研究对象空腹的状态下进行静脉血抽取，抽取量为3ml。
在本次研究中，实施免疫透射比浊法检测时所应用的仪器主要为Olym pus AU640型全自动生化分析仪（生产企业：上海执诚生物技术有限公司），实施免疫散射比浊法检测时所使用的仪器主要为man lmmage 800蛋白分析仪（生产企业：上海以达进出口有限公司）。
免疫比浊-袁汀
三、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒 （一般为0.2 μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗 粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚 ， 使透射光和散射光即出现显著变化。
（一）原理：
免疫比浊分析的主要影响因素
1．抗原抗体比例 抗原抗体比例要适当。 2．抗体的纯度与效价 诊断试剂应尽可能选择高 纯度与高效价的抗体。 3．免疫复合物的大小及稳定性 溶液中免疫复合 物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相 互聚集。
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
免疫比浊技术分类：
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）
终点散射比浊法 速率散射比浊法
一、免疫透射比浊法
（一）原理：
一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶 液时，由于溶液中的免疫复合物微粒对光线的吸收、 反射和折射而使透射光减少，可用吸光度表示。
4．增聚剂 利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层， 促进反应的进行。
5. 离子强度 PBS是较好的反应液 。 6. 标准曲线与质量控制
第二节 自动化免疫比浊分析
BNⅡ、BN100特种蛋白分析分析系统
透射免疫比浊改良
Array360、IMMAGE特种蛋白分析分析系统
散射免疫比浊
临床应用
免疫比浊分析法主要用于特定蛋白系列检测。如免 疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚 类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋 白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白 (HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、 脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些 治疗性药物浓度等。
自动化分析-(免疫比浊)
自动化免疫比浊
➢免疫比浊分析技术发展
两测定Biblioteka 原抗体形成后的阶段 个 测定抗原抗体结合的峰值
散射(终点)比浊
阶
段
速率散射比浊
散射比浊法:
当一束光
在光源的光路方向（50-960）
免 疫 比 浊
线通过溶 液受到光 散射和光 吸收两个
角的方向上测量透射光强度 和被检测溶液中微粒浓度关 系的方法。
法
因素的影
➢对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。
三、速率散射比浊分析
三、速率散射比浊分析 （一）基本原理
— 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。
— 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。
平光线
散射光θ
透射光
检测器 检测器
光源 透镜 滤光片
散射比浊、透射比浊光路图
实验要求（了解）
❖ 溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) ❖ 溶液中形成的复合物分子要足够多 ❖ 控制抗原抗体反应的温度和时间 ❖ 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 ❖ 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 ❖ 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)
Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量 呈正比，与散射光的夹角呈正比，与波长呈反 比。
在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积， 减小入射光的波长，扩大散射光夹角等因素， 均可增加检测的敏感度。
（二）反应物含量与散射浊度
Heidelberger曲线
免疫比浊法
免疫系
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性的 球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免疫 应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性细 菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。
应维持反应管中的抗体蛋白量始终粒可形成浊度，造成 假性升高。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
免疫比浊法的特点：
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少， 结果判断更加客观、准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向 临床反馈，又可节约大量人力物力，利于大批量样品的处 理。
临床免疫学：第七章 免疫比浊技术
絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应 双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊 散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由 于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收， 透射光减少，光吸收量增多。
• Mie散射(d ＞λ)
散射免疫比浊法
散射免疫比浊法
• 免疫复合物形成的散射光多数属于Rayleigh散射， 其光强度计算公式为：
适当增加抗原-抗体的体积，减少入射光的波长，减 小检测角度，以及使用激光、较短波长等高强度光 源作为入射光，都可提高检测灵敏度。
（θ=0 ？）
散射免疫比浊法的类型
• 5、抗体亲和力好、效价高，且保证过量；
透射免疫比浊法
• 方法评价
• 1、操作简单，重复性好，结果较准确； • 2、能用全自动或半自动化仪器进行检测； • 3、灵敏度比单向免疫扩散法高5～10倍，但
是比散射免疫比浊法低； • 4、要求抗原抗体复合物分子应足够多、足
够大，故耗时长。
根据透射光减弱的原理来定量，分子太小则入射光 直接通过，只能测定抗原-抗体反应的第二阶段。
累计时间（s） 形成IC总量 速率
5
8
－
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
实验测试方法免疫比浊法原理
实验测试方法免疫比浊法原理免疫比浊法（immunoturbidimetry）是一种常用的实验测试方法，用于测定血清或尿液中特定分析物质的浓度。
它基于免疫学原理，通过测量可见光的散射程度来获得目标物质的浓度信息。
在实验中，样品中的目标物质与专门设计的抗原抗体反应，形成可见性沉淀物，从而引起溶液的浑浊程度的变化。
免疫比浊法的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原抗体反应：在实验开始前，需要将抗原抗体组分预先混合。
抗原可以是目标物质的衍生物或合成物，而抗体是特异性识别和结合抗原的蛋白质。
2.沉淀形成：向样品中加入混合的抗原抗体溶液，使其与样品中的目标物质相互作用。
当目标物质存在于样品中时，抗体会识别并与其结合，形成可见性沉淀物。
3.光散射测量：实验中使用的光散射测量器可以测量光线通过沉淀物混浊的溶液时的散射程度。
目标物质的浓度越高，形成的沉淀物越多，溶液的浑浊程度越高，从而引起更强的散射。
4.标准曲线计算：为了准确测量目标物质的浓度，需要根据已知浓度的标准品制备一条标准曲线。
标准品的浓度范围一般从低浓度到高浓度逐步增加。
通过测量标准品和待测样品的散射程度，并使用标准曲线进行外推和内推，可以得出待测样品中目标物质的浓度。
免疫比浊法的优点包括操作简单、结果快速、成本较低和高灵敏度。
然而，它也存在一些限制和注意事项。
由于光散射测量主要基于理论计算，因此需要确保实验中的测量条件如温度、光源强度和检测器的响应都是稳定和准确的。
另外，免疫比浊法在样品中可能存在其他干扰物质时可能会失去灵敏度和特异性。
因此，在进行免疫比浊法实验时，需要进行一系列的控制实验来检测和排除干扰因素。
除了免疫比浊法，还有其他一些常用的免疫学方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）。
这些方法在分析物质浓度的测量范围、特异性和精确度方面可能略有不同。
因此，在选择适当的实验方法时，需要考虑样品性质、目标物质的特征和实验室的设备和技术条件。
免疫比浊法和免疫投射比浊法(修改版)
免疫比浊法和免疫投射比浊法1.定义：（1）免疫比浊法：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。
（2）免疫投射比浊法：当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。
一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。
2.原理（1）免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。
其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。
当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。
通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
（2）免疫透射比浊法是抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。
当光线通过溶液时，可被免疫复合物吸收。
免疫复合物量越多，光线吸收越多。
光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。
利用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。
本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。
3.关系4．免疫比浊法适用的仪器紫外可见分光光度计全自动生化仪全自动生化仪常见的检测方法终点法连续检测法比浊法均相酶免疫分析。
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免疫比浊法和免疫投射比浊法
1.定义：
（1）免疫比浊法：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。
（2）免疫投射比浊法：当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒
的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。
一般
采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。
2.原理
（1）免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。
其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规
定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促
聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使
反应液出现浊度。
当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的
量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增
加。
通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算
出检样中抗原的含量。
（2）免疫透射比浊法是抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。
当光线通过溶液时，可被免
疫复合物吸收。
免疫复合物量越多，光线吸收越多。
光线被
吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。
利用比浊
计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。
本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。
3.关系
4．免疫比浊法适用的仪器
紫外可见分光光度计
全自动生化仪
全自动生化仪常见的检测方法
终点法
连续检测法
比浊法
均相酶免疫分析。