免疫透射比浊法

免疫透射比浊法
一、原理
当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。

这一方法早于1959年Schultre和Schuick 等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。

其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。

在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。

某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。

只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。

在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。

溶液pH为6.5～8.0之间为宜。

载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。

为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。

图18-4 抗原抗体反应曲线
在免疫比浊过程中，由于抗原抗体结合的三过程，从而导致光密度与浓度之间不呈线性关系，一般是3次方程曲线关系。

若将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过3次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算，免疫比浊中，采用终点法或速率法，用5个或7个不同梯度进行定标，经3次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与光密度的关系曲线方程，才能作为定量的工作曲线。

二、血清ApoAⅠ（B100）透射比浊测定法
脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B100）的定量测定。

（一）手工操作
1．原理
血清ApoAⅠ（B100）+抗人ApoAⅠ（B100）→抗原抗体复合物→测定光密度
2．试剂（伊利康）
（1）Apo缓冲液（RⅠ），含4%PEG6000和表面活性剂
（2）羊抗人ApoAⅠ（B100）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。

（3）ApoAⅠ（B100）参考血清（RⅢ）
3．操作
（1）按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl，加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂（Apo抗体液）。

最好临用前配制当天用量。

（2）各试剂用量如下表
ApoAⅠApoB100
标准管测定管空白管标准管测定管空白管
参考血清5μl5μl
待测血清5μl5μl
ApoAⅠ抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml
ApoB100抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml 混匀各管，37℃保温10min，波长340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。

（3）定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点（3～9点），按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回归曲线进行定标，制作参考工作曲线。

①校正工作曲线的绘制：
配制抗血清稀释工作液：按RⅠ试剂0.9ml，加RⅡ试剂100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。

制备5点校正液：取RⅢ（参考血清），用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度，第5管为原参考血清浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。

表18-20 标准曲线制备的各管（点）浓度
管号 1 2 3 4 5
1号管（0）（μl） 5
2号管（1/8）（μl） 5
3号管（1/4）（μl） 5
4号管（1/2）（μl） 5
5号管（1/1）（μl） 5
Apo抗体液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀各管，置37℃水浴保温10min，按程序上机作工作曲线。

②标本测定：吸待测血清（测定管）5μl，加上述稀释抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保温10min，上机读数，打印结果。

③如测定值超过工作曲线上限值，仪器会打印显示“过高”，此时，将待测标本稀释1倍再测。

④每批号的抗血清应作一次多点定标，即测定标本的抗血清应与定标的抗血清是同一批号抗血清。

（二）生化分析仪测定
1．原理
脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B100）的定量测定。

ApoAⅠ（B100）+抗人ApoAⅠ（B100）→抗原抗体复合物→测定吸光光密度
2．双试剂单（双）波长法
（1）试剂（温州伊利康）
RⅠ：Apo缓冲液，含4% PEG6000和表面活性。

RⅡ：羊抗人ApoA（B100）稀释抗血清
RⅢ：Apo定值血清
（2）各试剂及标本用量如下表：
项目血清
Apo缓冲液
（RⅠ）ApoAⅠ抗血清液
（RⅡ）
ApoB100抗血清液
（RⅡ）
ApoAⅠ2～5μl300～350μl80～100μl
ApoB1002～5μl300～350μl80-100μl （3）定标：以5点Apo梯度浓度，采用免疫定标法按表18-21参数上机定标，如图18-5所示。

图18-5 ApoAⅠ五点免疫定标曲线图（以CL-7200仪器为例）
（4）上机（终点法或两点法）
（5）说明：①Apo测定的光密度从340～700nm范围都可采用，多用340nm；②国内已有的Apo试剂盒均无需处理；③血清标本也无需处理，均可直接检测；④本法适用于多种类型的全自动生化分析仪检测，自动扣除空白，快速准确；⑤效价不同的抗血清，其用量应作适当的调整。

(5)计算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定标自动运算。

3.单一试剂单波长法
(1)试剂同双试剂法
(2)标本及试剂用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相应的Apo缓冲液(RⅠ)0.3m l的比例混合成单一试剂(Apo抗体液)。

最好临用前配制当天用量,此抗体液置2～8℃保存一周有效。

（3）定标：按五点梯度稀释定值血清（见表18-21），以终点法或两点法进行免疫定标。

（4）按以下步骤操作：
（5）以△A=A2-A1值按免疫定标自动运算。

（6）说明：①该法一般用半自动生化分析仪；②通过设延迟时间以扣除空白；③RⅠ、RⅡ试剂以临用时混合为好，未用完的混合试剂应置于2～8℃冰箱保存，只允许使用一周；④血清标本无需再处理。

4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自动生化分析仪检测的有关数据。

（1）上机参数（以CL-7200型为例）如表18-21所示。

表18-21 自动生化分析仪检测Apo有关参数
ApoAⅠAⅡ B CⅡCⅢ E
反应类型终点法
样品量3μl3μl3μl8μl3μl5μl
600nm（第一）数据数据700nm 700nm 700nm
测量波长
700nm（第二）数据数据340nm 340nm 340nm
第一波长5min 数据数据数据数据数据
反应时间
第二波长4.99min 数据数据数据数据数据
试剂Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl
试剂Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl
单位g/L g/L g/L mg/dl mg/dl mg/dl。