免疫比浊法检测免疫球蛋白
两种免疫比浊法测定血清免疫球蛋白的结果差异探讨及解决方法
１ 试剂及校准 品 ｆ Ｉ ｍａｅ ． ２ １ ｍ ｇ 测定 ＩＧ ＩＡ、 Ｍ全 部配套 ） ｇ 、ｇ Ｉ ｇ 试剂ｆ 批号 ＩＧ Ｍ６ １０ 、 Ａ Ｍ １３ ０ ＩＭ Ｍ６ １ ２） ｇ １ ３ １ Ｉ ６ １０ 、ｇ ０ ２ ４与校准 ｇ 品ｆ 批号 Ｍ ０ ３ ８（ ６４５） 简称 Ｂ ｃ ｍ ｎ试剂１（） Ｉ ｅｋ ａ ： Ｉ Ｉ ２ Ｎ） 迈克试剂公 司 ＩＧ、 Ａ、 Ｍ定 量测定试剂盒（ ｇ Ｉ Ｉ ｇ ｇ 批号均为 ２ ０ ０ ０ ） ０ ５ ３ １， 试剂盒 自
２ 结 果
２１ 方 法 ｆ１ 射 比 浊 法 采 用 迈 克 试 剂 公 司 试 剂 ． 日立 ． １透 用
７０ ６ ０全 自动 生 化 分 析 仪 进 行 测 定 ｆ１速 率 散 射 比 浊 法 采 用 ２ Ｉ ａｅ免疫 化学 系统 进 行 ｆ１ 器 精 密 度 评 价 试 验 用 一 份 正 ｍｍ ｇ ３ 仪 常 浓 度 混 合 血 清 样 本 分 别 用 两 种 方 法 完 成 ＩＧ、ｇ ＩＭ 的 ｇ Ｉ Ａ、ｇ
１１ 仪 器 Ｂ ｃｍａ — ｏｌ ｒ 司 生 产 的 Ｉ ａｅ免 疫 化 学 ． ｅｋ ｎ Ｃ ｕ ｅ 公 ｔ ｍｍ ｇ 系统 ． 日立 ７ ０ ６ ０全 自动 生化 分析 仪
双 份 平 行 测 定 ．各 自重 复 ２ ０次 ．计 算 出两 种 测 定 方 法 的均 值 、 准 差 批 内１ 标 和变 异 系 数 （ ｖ批 内１此 即批 内 精 密 度 。 ｃ ．
带 校 准 品
钟 混 匀 分 别 测 定 ２次 求 均 值 ． 共 ２ 总 ０天 得 ２ ０个 数 据 ． 同样 计 算 均 值 、 准 差 批 间１ 变 异 系 数 （ ｖ批 问１此 为 批 间精 标 和 ｃ ，
放射免疫法与免疫比浊法检测脑脊液免疫球蛋白含量比较
格林 巴利 综 合征 患 者 脑 脊 液 中 的免 疫 球 蛋 白浓 度 是确 诊格 林 巴利综 合 征 的一 项 重 要指 标 ， 效 性 高 、 确 性 强 的 有 准
临床 检验 方 法对 于临 床诊 治具 有指 导 意义 。 者通 过 两种 方 笔 法进 行检 测 ， 将本 院检 测结 果 和经 验报道 如下 ： 现 １ 资 料 与 方 法
淀物 的放射性 ， 根据 结果 制作 标 准 曲线 图。 免疫 比浊 法 ： 齐 备 ｌＧ、 Ａ、 Ｍ 试剂 盒 、 准 品 等 必 备 品 后 ， 用 Ａｒ ｙ ６ ｇ Ｉ Ｉ ｇ ｇ 校 应 ｒ ３ ０特 ａ 种 蛋 白分 析 仪 和美 国雅 培 Ａ Ｂ Ｔ ｅｏｅ 全 自动 生化 仪 ， Ｂ Ｏ ＦＡ ｒｓｔ 严格 按 照操 作说 明进 行 。
比 浊 法 线 性 范 围 高 于 放 射 免 疫 法 （。４１ ，＝ ．１ ） ｘ＝ ．６ Ｐ ００ ６ 。
２２测 量 灵 敏 度 ．
比浊法灵敏 度较放 射免 疫法 低 ， 性 范围较放 射免 疫法 宽 ， 线 根 据 两组 数据 显示 其灵 敏度 及线 性 范围 均能 满足 临床应 用 。 本
的 时 问不少 于 ２ｈ 每批 对 样 本 做双 份 测定 ， 均 值 ， ， 取 计算 批
内 、 间 、 间和总 精 密度 ， 一批 测定 均做 一次 质控日 得 出 批 天 每 。 标本 批 内变异 系 数 （ Ｖ） ２３ ， 问 Ｃ Ｃ 为 ．％ 批 Ｖ为 ３１ 天 间 Ｃ ．％， Ｖ
一
射性 标 记 的抗 原 的量 ， 而 计算 出相应 的结 果 。放 射免 疫法 从 存 在放 射 性 核 素污 染 ． 试剂 保存 期 短 ， 作 繁杂 ， 性 小 ， 操 线 要 批量 做 ， 果报 告不 及 时 ， 结 对高 浓 度标 本需 稀 释重 做 ， 但费 不 时 费力 ． 而且手 工稀 释 ， 以满 足实 验室 和 临床 的要求［ 难 ４ １ 。
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)检测试剂盒(免疫比浊法)产品技术要求
医疗器械产品技术要求编号：免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）检测试剂盒（免疫比浊法）1.产品型号/规格及其划分说明序号规格12×200Tests2R1：2×80ml、R2：2×20ml3R1：2×60ml、R2：2×15ml4R1：2×40ml、R2：2×10ml5R1：2×50ml、R2：1×25ml6校准品（选配）：1×1ml2.性能指标2.1外观试剂R1溶液应无色、无颗粒、无杂质、无沉淀和悬浮物；试剂R2溶液应呈淡黄色、无颗粒、无杂质、无沉淀和悬浮物；校准品为米白色至浅黄色冻干粉末。
2.2净含量试剂盒各试剂装量应不小于标示值。
2.3试剂空白吸光度应为≤0.4，IgA、用蒸馏水作为样品加入试剂测试,IgG试剂空白吸光度A570nm应为≤0.4。
IgM试剂空白吸光度A340nm2.4分析灵敏度测试IgG：4.85g/L、IgA：0.94g/L、IgM：0.47g/L被测物时，吸光度差值（△A）IgG应不小于0.20、IgA应不小于0.20、IgM应不小于0.05。
2.5线性范围IgG：在（0～35.0）g/L范围内，其线性相关系数r≥0.990；浓度≥5.0g/L 时，相对偏差≤20%；浓度＜5.0g/L时，绝对偏差≤1.0g/L。
IgA：在（0～8.0）g/L范围内，其线性相关系数r≥0.990；浓度≥1.3g/L 时，相对偏差≤20%；浓度＜1.3g/L时，绝对偏差≤0.4g/L。
IgM：在（0～4.8）g/L范围内，其线性相关系数r≥0.990；浓度≥0.4g/L时，相对偏差≤20%；浓度＜0.4g/L时，绝对偏差≤0.2g/L。
2.6测量精密度2.6.1重复性用控制血清重复测试所得结果的重复性（变异系数，CV）应≤6.0%。
2.6.2批间差批间差应≤10.0%。
2.7准确度用参考物质进行测试，其相对偏差应≤20.0%。
免疫球蛋白定量的测定方法
免疫球蛋白定量的测定方法
免疫球蛋白定量的测定方法，这可真是个超级重要的事儿啊！你知道吗，就好像我们要了解一个神秘宝库里面到底有多少宝贝一样。
先来说说单向免疫扩散法吧，这就像是在一个大平地上，让免疫球蛋白和特定的抗体慢慢扩散开来，然后形成一个个独特的沉淀环，通过测量这些沉淀环的大小，不就能知道免疫球蛋白的量了嘛！是不是很神奇？
还有免疫比浊法，哇哦，这就好像是一场激烈的比赛！让免疫球蛋白和抗体在特殊的环境里“较量”一番，然后通过观察溶液的浑浊程度来判断免疫球蛋白的多少，这多有意思呀！
还有呢，酶联免疫吸附测定法，这简直就是一个精心设计的实验舞台呀！把免疫球蛋白和各种试剂放在一起，通过一系列反应，最后用特殊的方法检测出结果，就像是一场精彩的魔术表演，最后谜底揭晓，我们就知道免疫球蛋白的量啦！
放射免疫测定法也不能落下呀！就如同能看到微观世界的神奇眼睛，利用放射性物质来精确测量免疫球蛋白的量，这是多么高妙的手段呀！
这些方法各有各的特点，各有各的厉害之处，不是吗？它们就像一群各具本领的超级英雄，为了我们的健康而战斗！我们能不好好了解它们吗？免疫球蛋白定量的测定方法真的是太重要了，它们是医学领域的得力助手，帮助医生们更准确地了解病情，为患者提供更好的治疗方案。
我们应该对这些方法充满敬意和感激，它们是守护我们健康的无声卫士啊！。
免疫球蛋白G测定试剂盒(免疫比浊法)产品技术要求lepu
免疫球蛋白G测定试剂盒(免疫比浊法) 适用范围：用于体外定量测定人血清中免疫球蛋白G的浓度。
1.1 规格试剂1:1×60mL，试剂2:1×12mL；试剂1:1×60mL，试剂2:1×15mL；试剂1:1×60mL，试剂2:1×20mL；试剂1:3×40mL，试剂2:3×20mL；试剂1:2×50mL，试剂2:2×10mL；试剂1:1×45mL，试剂2:1×9mL；试剂1:1×5L，试剂2:1×1L；试剂1:2×5L，试剂2:1×2L。
1.2 主要组成成分试剂1主要组分：试剂2主要组分：2.1 净含量应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观试剂1应为无色或浅色液体，试剂2应为无色或浅色液体。
外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白在700nm处测定试剂空白吸光度，应≤1.9。
2.4 分析灵敏度测试10g/L的被测物时，吸光度变化（ΔA）应不低于0.0025。
2.5 准确度在样品中加入一定体积的纯品，计算回收率，应介于90%-110%之间。
2.6 重复性批内变异系数（CV）应不超过10％。
2.7 线性2.7.1在[0.3，25]g/L区间内，线性相关系数r应不低于0.990；2.7.2 在[0.3，3.0)g/L区间内，绝对偏差不超过±0.36g/L；在[3.0，25]g/L 区间内，相对偏差不超过±12%。
2.8 批间差对同一份样品进行重复测定，相对极差≤12％。
2.9 空白限空白限为0.01g/L。
2.10 稳定性取在2℃～8℃条件下贮存达到12个月后的试剂进行检测，应符合本标准2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.9之规定。
免疫比浊法PPT
异性聚集影响结果。
免疫比浊法的特点：
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
+校准品 （10mL）
混匀 37℃,10min
OD340
样本管
+样品血清 （10mL）
结果计算方法：
实验结果
样本管吸光度 Ig浓度（g/L）×= Ig校准浓度（g/L）
校准管吸光度 IgA：1.72 g/L IgG：9.77 g/L IgM，除非放置较长时间 。
如要形成较大的的复合物，抗原抗体量应较大。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水，
血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
实验方法
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
免疫系
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性的 球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免疫 应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性细 菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损
实验1 免疫比浊法检测免疫球蛋白
实验原理
合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG的作用下形成微粒，使 样品的浊度发生变化
可用分光光度仪测量反应液体的浊度。当抗体浓度固定，样品的浊度与 其中所含有的抗原量成正比。
由于免疫复合物的形成有时限变化。当抗原抗体相遇后立即结合成小复 合物，几分钟到几小时才形成可见的复合物，这种速度太慢，加入聚合 剂（或促聚剂）可加速大的免疫复合物形成。
散 射光
θ
检测器
散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。 其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
实验材料
免疫球蛋白A,G试剂 免疫球蛋白A、G校准品（Mix），蒸馏水 微量加样枪、EP管 分光光度仪、水浴箱
IgG R1 250μL
IgA RI 150μL
对照/标准品/
样本 2 μL
混
匀
37
医学免疫学实验
上海医学院免疫学系
2016-3-9
INSTITUTE FOR IMMUNOBIOLOGY DEPARTMENTOF IMMUNOLOGY
实验室注意事项：
实验安全
戴手套操作，注意试剂不要溅到眼里嘴里，有问题及时和老师沟通。
实验卫生
实验结束后学生收拾桌面，物归原处，移液器调回最大量程。值日生打 扫卫生，装好枪头，收拾垃圾，（垃圾扔在走廊西侧垃圾桶内）。
℃
水
浴
5
对照/标准品/ 分
样本 3 μL
钟
IgG R2 85μL 混
匀 37 ℃ 水 浴 5 IgA R2 分 50μL 钟
检测 OD700
试剂1（R1）： Tris缓冲液 20mmol/l 聚乙二醇-6000 4% 试剂2（R2）： Tris缓冲液 20mmol/l 羊抗人IgA/G抗体
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免疫比浊法检测免疫球蛋白
免疫比浊法检测免疫球蛋白
一、实验目的
利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。
（本小组检测的为IgG样品）
二、实验原理
1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。
反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。
影响因素有：电解质、温度、酸碱度。
2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG 作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。
当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。
分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。
当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。
不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。
②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。
（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。
其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
本实验采用透射法。
3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性
聚集影响结果。
三、实验材料
免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）
免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管）
微量加样枪、ep管（1.5mL离心管）
酶标仪、水浴箱
四、实验步骤
1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。
2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。
3.混匀后37℃水浴5min。
4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。
5.混匀后37℃水浴10min。
6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。
五、实验结果与数据处理
2.标准曲线
3.样本浓度：y=0.604代入x=26.648g/L
由此得稀释之前样本的浓度为79.945g/L
误差：（79.945-34.8）/34.8*100％=129.73%
误差分析：
①抗原抗体反应需要一定孵育时间和温度，而操作中由于加样的速度限制，无法严格控制各管的反应时间；本次制作标准液时量极小，很有可能出现未混匀、挂壁的情况；标准液吸取量小会导致移液枪的误差被放大。
②免疫比浊法的基本原理是基于抗原抗体结合，而这个结合反应有特殊性，只有在一定范围浓度中，两者比例合适时检测结果才准确，否则会产生带现象，已有文章表明，稀释前后检测结果偏差很大(朱爱萍, 郭书云, 赵锐. 免疫比浊法检测异常血清免疫球蛋白的方法学探讨[J]. 现代检验医学杂志, 1999(4):33-34.)，所以我认为此样本虽然是由原液稀释三倍所得，但在溶液中IgG抗体的浓度都相同的情况下，两管中抗原抗体比例相差很大，所以检测结果也有偏差是可以理解的。
同时再结合散点图拟合出的标准曲线，可以发现，浓度较高的两管标准液距离拟合曲线的偏差是最大的，由此推断，1：1原液和1：2原液并不适合本次实验中所给的羊抗人抗体浓度（未知）。
所以，误差来源除了以上所说原因之外，还有本次实验提供的抗体浓度，并不适合原液中IgG浓度的检测，而稀释三倍后的样品属比较适合的范围。
所以最大的误差来源是抗体浓度的选择，虽然抗体浓度是保证过量的，但是过量的程度相对每个管来说是不同的，1：1和1：2也许需要更大的浓度。
六、思考
1.本实验采用的免疫比浊法适用于人体内哪几种Ig？
人体血清中含有五类免疫球蛋白，分别为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中前三种含量相对较高，而IgD和IgE含量极低，膜结合型IgD构成BCR，是Bcell成熟的标志，IgE在正常人血清中含量最少，与Ⅰ型超敏反应和寄生虫感染有关。
理论上此五种Ig均可以采用免疫比浊法检测含量，但临床上常只检测前三种含量较高、疾病相关性更强的Ig，在考虑寄生虫感染和变态反应性疾病时还可以检测血清中IgE 的含量。
2.检测血清等体液标本中某种抗原分子的方法？
原理同本实验，采用抗原抗体结合的原理，凝集反应、沉淀反应、
中和反应，以及免疫荧光法和酶联免疫吸附试验等，在使用抗原抗体结合原理时，将抗体加入荧光可以直接检测荧光强度来定量检测抗原含量，而酶联免疫吸附试验还可采用双抗体法以级联放大更易检测。
3.使用免疫比浊法时，抗原抗体的比例应采用哪个区域？
应采用抗体过量的前带，因为所检测的物质是抗原，希望所加样品中的抗原完全与抗体结合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶标仪中透过的光线。
因为吸光度OD值与溶液中颗粒的浓度成正比，而计算时默认颗粒的浓度与样品中所含抗原的浓度相当，所以，只有在抗体含量过量时，才能保证所有抗原都能与抗体结合形成微粒，降低因抗原未完全结合抗体所带来的误差。
而且结合本次误差，不同管抗体过量的程度也应该大致相当。
4.为何波长选择700nm？
抗原抗体结合后的吸光度受抗原抗体种类的影响，本次采用的是羊抗人Ig抗体，应该由经验值可知700nm是IgG抗原抗体结合后最大的吸收波长，在最大吸收波长处通过测吸光度来测浓度所得结果的误差最小。