1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理PPT
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PCR技术在新冠病毒核酸检测中的运用
谢谢聆听！
• （4）病毒生存：空气、气溶胶--3小时；纸质材料--24小时；铜 表
•
面—4小时；塑料和不锈钢表面--2-3天。
• （5）传染途经： 蝙蝠-中间宿主-人的传播？
•
飞沫传播、气溶胶传播、接触传播、经口传
•
播？、血液传播？
• （6）冠状病毒灭活：原理是破坏蛋白质膜；对热敏感，56 ℃30
•
分钟、乙醚、75%酒精、含氯消毒剂、过氧
•
乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。
•
氯已定不能有效灭活病毒。
标本采集、运送防护和处理
一、标本采集、运送：
1、采集：单独有通风的房间、房间有消毒设施和消毒程序，采集 人员 要三级防护。
采样管：含保存液的病毒采样管、含灭活剂的采样管（标准病毒 运输液、化学灭活剂如胍盐类）
标本采集、运送防护和处理
（2）基因组全长同源性比对：其与 SARS-CoV Tor2 相似度 79.0%，与 MERS-CoV 相似度 51.8%。与分离自中华菊头蝠的蝙蝠冠状病毒 SL-CoV ZC45和ZXC21有 87.6% 和 87.7% 的相 似度。然而，冠状 病毒高度保守的 RdRp 序列与 SL-CoVZC45 相比，只有 86.3%-86.5% 的 相似度，故认为新发现的冠状病毒种应该为 Betacoronavirus 属，Sarbecovirus 亚属下的 一种新型冠状病毒。
• （5）核心工作间（core area）是生物安全实验室中开展实验室活动的主要区域， 通常是指生物安全柜或动物饲养和操作间所在的房间。
PCR实验室
三、新冠病毒核酸检测
新冠病毒核酸检测
新冠病毒的生物学特性 相关指南和标准 标本采集、运送防护和处理 个人的防护等级 人员和实验室要求 核酸检测
核酸检测技术PPT课件
28
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
……
26
2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
21
PCR的扩增？
22
The first cycle
The second cycle
How does PCR work
23
The third cycle
The fourth cycle
24
How does PCR work
2. PCR的类型
25
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR） 7. Overlap PCR
平台期
平台期
基线期
Cycle（循环数）
39
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
……
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2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
21
PCR的扩增？
22
The first cycle
The second cycle
How does PCR work
23
The third cycle
The fourth cycle
24
How does PCR work
2. PCR的类型
25
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR） 7. Overlap PCR
平台期
平台期
基线期
Cycle（循环数）
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pcr技术原理实验步骤和应用过程
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
PCR分子诊断技术ppt课件
遗传性疾病的诊断及预防 包括：染色体疾病、血红蛋白病、血友病、遗传性耳聋、糖尿病等
肿瘤标志物的监测与诊断 包括：乳腺癌、肠癌、白血病等
个体化用药的临床指导 包括：药物作用靶点相关基因、药物代谢酶基因、药物副作用相关基因等
• PCR临床意义：
快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物 感染；
了解体内感染的数量、复制程度，是否具有 传染性；
退火：DNA加热变性成单链后，当温度降至一 定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链 的互补序列配对结合。
延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板 上的引物以dNTP为原料，按A－T、C－G碱基配对 与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链 互补的链。
3
重复上述变性－退火－延伸的循环过程， 每一循环获得的“半保留半复制”链继续成为下 次循环的模板。通常一个完整的循环时间需 要2-4min，2-3h就能将靶核酸放大几百万倍。
是PCR技术实现自动化的关键，是从嗜热古 细菌中最早分离出的，最常用的DNA聚合酶。
2
脱氧核甘三磷酸（dNTP） 标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三
磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 二价阳离子
所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常 用的是Mg2＋，Mn2+ 缓冲液
通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因， 为临床患者提供快速准确的确诊检测。
实时荧光定量PCR法
• 概念 指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的
先后顺序以及信号强弱的变化来及时分析目的基因的拷 贝数目，通过与已知量的标准品进行比较，实现实时定 量的方法。 • 反应过程
在实时荧光定量PCR反应过程中，对整个过程进行了实 时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应 时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条 曲线。产生的DNA拷贝数是呈指数方式“S”增加的，随 着反应循环数的增加，最终不再以指数方式生产模板， 而进入“平台期”。
肿瘤标志物的监测与诊断 包括：乳腺癌、肠癌、白血病等
个体化用药的临床指导 包括：药物作用靶点相关基因、药物代谢酶基因、药物副作用相关基因等
• PCR临床意义：
快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物 感染；
了解体内感染的数量、复制程度，是否具有 传染性；
退火：DNA加热变性成单链后，当温度降至一 定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链 的互补序列配对结合。
延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板 上的引物以dNTP为原料，按A－T、C－G碱基配对 与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链 互补的链。
3
重复上述变性－退火－延伸的循环过程， 每一循环获得的“半保留半复制”链继续成为下 次循环的模板。通常一个完整的循环时间需 要2-4min，2-3h就能将靶核酸放大几百万倍。
是PCR技术实现自动化的关键，是从嗜热古 细菌中最早分离出的，最常用的DNA聚合酶。
2
脱氧核甘三磷酸（dNTP） 标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三
磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 二价阳离子
所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常 用的是Mg2＋，Mn2+ 缓冲液
通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因， 为临床患者提供快速准确的确诊检测。
实时荧光定量PCR法
• 概念 指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的
先后顺序以及信号强弱的变化来及时分析目的基因的拷 贝数目，通过与已知量的标准品进行比较，实现实时定 量的方法。 • 反应过程
在实时荧光定量PCR反应过程中，对整个过程进行了实 时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应 时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条 曲线。产生的DNA拷贝数是呈指数方式“S”增加的，随 着反应循环数的增加，最终不再以指数方式生产模板， 而进入“平台期”。
PCR技术在医学检验中应用PPT
PCR技术在医学检验中应 用
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
1PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理ppt课件
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
9
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
10
第三代PCR：实时荧光定量PCR
14
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
26灵敏度高特异性强快速简便应用范围广27新药验证28传染病发病的监控预测与预防29对新型冠状病毒2019ncovorf1ab及编码核衣壳蛋白或e基因的特异性保守序列为靶区域进行了双靶标基因的设计配以pcr反应液在荧光定量pcr应用实时荧光定量rtpcr检测技术通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒rna检测
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
1
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
9
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
10
第三代PCR：实时荧光定量PCR
14
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
26灵敏度高特异性强快速简便应用范围广27新药验证28传染病发病的监控预测与预防29对新型冠状病毒2019ncovorf1ab及编码核衣壳蛋白或e基因的特异性保守序列为靶区域进行了双靶标基因的设计配以pcr反应液在荧光定量pcr应用实时荧光定量rtpcr检测技术通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒rna检测
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
1
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理
核酸的生化基础与检测原理(新冠肺炎核酸检测学习专家课堂)
核酸的生化基础与检测原理一核酸的生化基础与特性二PCR 技术三实时荧光PCR技术四其它核酸检测技术一核酸的生化基础与特性核酸可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA） 是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成，其基本结构单位是核苷酸。
核酸戊糖 碱基磷酸 核苷核苷酸核酸核苷酸核酸是通过一个核苷酸的C3 ′-OH 与另一分子核苷酸的5 ′-磷酸基形成3 ′,5 ′-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。
5’3’5’3’核酸的一级结构∙由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP四种脱氧核苷酸通过3´, 5´ -磷酸二酯键按一定顺序排列而成的高分子化合物。
∙一级结构的走向为5´→3´。
不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。
碱基配对• DNA 复制•DNA 聚合酶催化• 双螺旋结构与核酸检测相关的理化特性1.紫外吸收•在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在260 nm有吸收。
•核酸定性、定量、纯度测定的依据。
•根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA或相当于40μg/ml单链DNA或RNA或相当于20μg/ml寡核苷酸2. 核酸的水解•核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离。
大于4时，呈阴离子状态。
•核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。
•DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。
室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。
•在细胞内核酸分子受DNA酶作用。
•避免RNases的污染是在物理或化学因素作用下核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。
3.DNA的变性能引起核酸变性的因素有：l 温度升高l 酸碱度改变、 pH（>11.3或<4.0）l 有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等l 低离子强度。
热点专题13PCR技术及其应用-2025年生物学高考总复习课件
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高考总复习·生物学
(5)结果分析。
①两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循
环次数的增加，目的基因含量会不断增加。
②通过以上分析可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除
目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环
产生的4个DNA分子)。
量PCR(RT-PCR)检测法，技术流程如下图所示，①②③表示相关步骤。
请回答：
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高考总复习·生物学
(1)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是___________。
半保留复制
RT-PCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加
逆转录
酶。
蛋白酶K能催化
(2)过程①中，RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是_______________
高考总复习·生物学
2.PCR的原理
(1)DNA分子的热变性原理。
当温度超过90 ℃时，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称
为变性。温度缓慢降低到50 ℃左右时，两条彼此分离的DNA链重新结合
成双链，这个过程称为复性。
DNA双链
DNA单链
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高考总复习·生物学
(2)耐高温的DNA聚合酶。
高考总复习·生物学
热点专题13 PCR技术及其应用
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高考总复习·生物学
［热点归纳］
1.概念
PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原理，在
体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技
术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。
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三、PCR技术简介
➢ 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过 程称为变性。
➢ 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链， 这一过程称为复性。
➢ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，它的特异性取决于与靶序列两➢ 设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
PCR扩增示意图
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 12
二、PCR的发展史
➢ 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学, 分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。
➢ 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
➢ 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其 扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望 的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
24
38
4 16
5 32
30次循环后靶序列扩增6的数量64
20 1,048,576
常用的ＰＣＲ技术
➢ 定性ＰＣＲ 电泳检测、放射自显影 特异性差、易污染、只能定性
➢ ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ 特异性较好，极易污染、定量不准确
➢ 终点法荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好
➢ 实时荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
➢ 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反 应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累 积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板进行定量分析的方法。
第四代PCR：数字PCR
➢ 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定 量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件 下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字 PCR"应运而生。
第一代：手动/机械手式水浴基因扩增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR 的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸 温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在 不同温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错； 而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无
➢ 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数 字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
核酸的基本结构
遗传信息传递的中心法则
➢ DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配 对的原则进行半保留复制。
➢ 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR） 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技 术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大 特点是能将微量的DNA大幅增加。
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理
一、核酸基本知识
➢ 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志 ➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA
dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特 定基因的体外复制。 ➢ 周而复始的升降温度进行扩增，每一循环 可以使靶序列增加一倍。
PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
四、实时荧光PCR技术
➢ 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法。
➢ 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧 光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电 泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖 电泳的方式对PCR产物进行分析，但存在 着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉 污染风险大等不足。且无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。
第三代PCR：实时荧光定量PCR
➢ 为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的 表达水平进行定量分析，1992年诞生了所 谓“第三代PCR"的荧光定量实时PCR。
➢ 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。
➢ 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具 有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点， 目前已得到广泛应用。