实验1显微镜的使用细菌的简单染色
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
显微镜的使用和细菌简单染色
（二）光学显微镜的油镜原理
显微镜的分辨率D：是指显微镜能辨别两点之间 的最小距离的能力，即最小分辨距离。D越小，分 辨率越高。
D=λ/2NA λ为光源光波波长， NA为物镜的数值孔径值
数值孔径值 NA= η sinθ θ为物镜镜口角的半数， η为香柏油的折射率（1.52）
比如：水的折射率1.33， 空气的折射率为1.0 NA香柏油=1.2-1.4， D油镜=0.2μm＞细菌直径0.5μm
光学显微镜的结构示意图
三、实验器材
1、菌种：蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、染色液和试剂：美蓝染液、复红染液 3、器材：载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜
四、方法和步骤
1.涂片：在载玻片中央滴一滴蒸馏水，无菌接种环 挑取少量菌体与水滴混合均匀，涂成薄的 菌膜。
6. 干燥：自然干燥或用吸水纸盖在涂片处吸取多余 水分。
7. 观察：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观 察细菌的形态。
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
六、实验完毕后的处理
1.将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
显微镜的使用和 细菌的简单染色
一、实验目的
1.熟悉光学显微镜使用方法 2.掌握细菌的涂片和简单染色法的 基本方法和步骤
二、基本原理
（一）简单染色基本原理 通常采用碱性染料进行简单染色: 这是因
为细菌在中性、碱性和弱酸性环境中通常带负 电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部 分带正电荷，因此碱性染料（美蓝，结晶紫， 碱性复红等）很容易与细菌结合使其着色。
微生物实验
2、学习区分酵母菌死活细胞的方法
二、实验原理
酵母菌是单细胞真核微生物，其大小为常见细 菌的几倍至几十倍。大多数酵母采用出芽方式进 行繁殖。
美蓝是一种弱氧化剂，其氧化态呈蓝色，还 原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，由 于新陈代谢，活细胞具有较强的还原能力，可使 美蓝由蓝色的氧化型转变为无色的还原型，染色 后细胞呈无色。死细胞或代谢能力弱的衰老细胞 其还原能力弱，染色后细胞呈蓝色。
2、染色 初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1min后， 用水洗去剩余染料。 媒染 滴加卢戈氏碘液，1min后水洗： 脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不 再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至 1min)。 复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 用滤纸吸干，油镜镜检。 3、结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡 红色。
二、实验原理2
细菌的单染色
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌 体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察 到其形态和结构。
染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和 化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的 形态。
革兰氏染色与细胞壁： 肽聚糖 外膜
外膜蛋白
周质空间
三、材料
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的斜面培养物 革兰氏染色液：结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95％乙醇、石炭酸复红液 香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、接种环、 载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯、 蒸馏水。
四、实验步骤
1、制片 涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环， 用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、 直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 （三区法） 干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火 焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上， 便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面 向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止 菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。
细菌的简单染色实验报告
细菌的简单染色实验报告
《细菌的简单染色实验报告》
在生物学实验室中，我们进行了一项关于细菌的简单染色实验。
通过这个实验，我们希望能够观察和了解细菌的形态特征，为进一步的研究和分析奠定基础。
首先，我们准备了一份细菌样本，并将其涂抹在玻片上。
接着，我们使用了一
种叫做墨汁的染色剂，将其滴在细菌样本上。
墨汁中的颜料分子能够与细菌细
胞壁中的化学物质发生作用，使细菌在显微镜下更加清晰可见。
在染色完成后，我们将玻片放置在显微镜下进行观察。
通过放大镜头，我们可
以清晰地看到细菌的形态和结构。
有些细菌呈现出圆形或椭圆形，而有些则呈
现出长条状或弯曲形态。
这些观察结果为我们提供了宝贵的信息，帮助我们更
好地了解细菌的特征和分类。
通过这个简单的染色实验，我们不仅能够观察到细菌的形态特征，还能够为后
续的细菌研究提供重要的参考。
细菌在自然界中起着重要的作用，它们不仅存
在于我们周围的环境中，还对人类健康和生态平衡产生着重要影响。
因此，对
细菌的研究和了解具有重要意义，而这个简单的染色实验为我们提供了一个很
好的起点。
通过这次实验，我们不仅增加了对细菌的认识，还学会了使用染色技术来观察
微生物。
这将为我们今后的学习和研究打下坚实的基础，也让我们更加深入地
了解微生物世界的奥秘。
希望通过我们的努力，能够为细菌研究领域的发展做
出一些贡献。
实验一显微镜的使用和细菌的简单染色
实验程序——细菌简单染色
每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。
蒸 馏 水
涂片
接 种 环
自然干燥
吕 式 美 兰
固定
擦拭
染色 1min
干
水
燥
洗
水洗时不要直接冲菌膜
染色注意事项
• 1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，
涂菌要均匀，不宜过厚。
• 2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫
• 普通光学显微镜(NIKON) • 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜 • 麦克奥林生物显微镜
镜座 载物台
镜臂
机械装置 标本夹和标本移动尺
显 微
粗调螺旋和细调螺旋
镜 的
聚光镜升降螺旋
构 造
接目镜
接物镜及镜头转换器
光学系统 聚光镜
虹彩光圈
反光镜
显微镜的放大倍数和分辨率
• 1.放大倍数=接物镜放大倍数×接 目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
• 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用 高倍镜或油镜观察？
下周实验
实验二 细菌的革兰氏染色 （书中实验十四）
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
大肠杆菌
杆菌
变形杆菌 绿脓杆菌
大肠杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
Spirulina sp. - Filamentous Cyanobacte
微生物学实验报告
微生物学实验报告实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察第一部分：显微镜的使用一、目的要求1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。
2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。
3．了解各种显微镜的主要特征。
二、实验原理（一）光学显微镜的构造微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。
1、机械部分普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。
2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。
（二）放大倍数标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。
总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。
物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。
显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。
分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。
因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。
R=0.61λ/N.A式中：R-----分辨距离；λ------作用光的波长；N.A------数值口径。
一些介质的折射率介质折射率空气水玻璃香柏油1 13 55 1.56三、实验内容（一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。
（二）方法：细菌很小，须使用油镜方可观察到。
油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。
2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。
在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。
然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。
环境微生物实验教案
实验一显微镜使用与细菌染色法一、实验目的1．学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。
2．学习掌握细菌简单染色和革兰氏染色方法。
二、显微镜的结构与功能1．显微镜的结构显微镜有机械装置和光学系统两大部分组成。
机械装置主要作用是使光学系统，紧固在一个光轴直线上，而且可精确地调节各光学系统部件之间的距离，使显微镜产生清晰的物象。
其组成包括：①镜座和镜臂；②镜筒；③物镜转换器；④载物台；⑤调焦装置（粗调节器和细调节器）。
光学系统使显微镜最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。
其组成包括：①目镜；②物镜；③集光器；④反光镜；⑤光源（自然光源和电光源）。
光学显微镜基本结构：1. 照明灯(Lamp)2. 聚光器(Condenser)3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimenretainer)4. 推进器(Mechanicalstage adjustment knob)5. 物镜(Objectives)6. 粗细螺旋(Course andfine focus knob)7. 目镜(Oculars)8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.)2．显微镜的成像原理标本得到足够的照明由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45 度的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像在经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的实虚像。
3．分辨力与数值孔径显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。
这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。
1．数值孔径数值孔径（又称开口率numerical aperture 简写NA）是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。
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很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
㈢ 细菌的简单染色
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
细菌个体微小，无色透明，不经过染色，常常不容易观 察。经过染色后，菌体与背景颜色形成鲜明的颜色对比，便 于在显微镜下观察细菌的形态、大小和排列方式。
利用同焦现象，在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作 距离短的物镜时，仅用微动螺旋即可对物像清晰聚焦，从而避 免由于使用粗动螺旋时可能的错误操作而损坏镜头。
4 油镜观察 注意不要因为在下降物镜镜头时用力过猛或者调焦时误
将粗动螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 不可以将高倍镜转动经过加油镜油的区域。
调节目镜间距和屈光度。
瞳距调节
屈光度调节：可以适应双眼视力有差异的观察者。
2 低倍镜观察
养成良好的调焦习惯，先从侧面注视，小心调节物镜靠近 标本，然后用目镜观察，以防操作失误而损坏镜头。
3 高倍镜观察
一般情况下，当物像在一种物镜中清晰聚焦后，转动转换 器将其它物镜转到工作位置，物像保持基本准焦状态，称为物 镜的同焦(parfocal)。
㈠ 普通光学显微镜
微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到，显微镜 是微生物学者不可缺少的基本工具。
普通光学显微镜利用目镜、物镜两组透镜系统来放大成 像，常称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组 成。
1 机械装置 镜座和镜臂：镜座支持整个显微镜，镜臂支持镜筒部分。
镜筒：上接目镜，下接转换器，分为单筒和双筒两种。
目镜：安装在镜筒上端，由两块透镜组成，将物镜成的像 再次放大，但是不增加分辨力，目镜放大倍数过大，反而影响 观察效果。
聚光器：由聚光镜和虹彩光圈组成， 调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，使 适当强度的光线照射到标本上。
光源：安装在镜座内，通过开关控制。
滤光片：可见光由不同波长的光线组 成，使用滤光片可以得到所需的一种波长 的光线，提高分辨率、增加反差。
一台显微镜由机械装置和光学系统组成，其中物镜是显 微镜最重要的部件。
物镜通常有三种，低倍镜、高倍镜、油镜。低倍镜的放 大倍数一般为4-10×、高倍镜的放大倍数一般为40-45×、油 镜为95-100×，是放大倍数最大的物镜。
㈡ 油镜的工作原理 1 提高分辨率
分辨率是决定显微镜观察效果的重要指标， 显微镜分辨 率越高，能达到的最小可分辨距离越小。
微生物学实验
生命科学学院
实验一 显微镜的使用 细菌的简单染色
(3学时)
实验内容涉及教材：实验2、7、12等。
一 目的要求
1 复习普通光学显微镜的结构、功能和操作技术；学 习油镜的工作原理和使用方法；
2 掌握细菌的制片和简单染色技术，观察球菌和杆菌 等在光学显微镜下的基本形态特征；
3 建立“无菌概念”，体会无菌操作的重要性。
5 显微镜用毕后处理
下降载物台，取下载玻片；分三步用擦镜纸清理镜头。
将显微镜还原。包括将光源灯亮度调至最低后关闭；将 最低放大倍数物镜转到工作位置；载物台及聚光器降至最低 位置。
五 注意事项
1 严格、标准的进行无菌操作。 2 涂片时取菌量要适宜而且要涂抹均匀。 3 注意油镜头的清理。 4 注意显微镜用后还原。
用于生物染色的碱性染料不是碱而是一种盐，碱性染料 电离时染料离子带正电荷，而细菌蛋白质的等电点较低，当 它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液时常带负电荷，这样带 负电荷的细菌很容易与带正电荷的染料离子结合而使细菌着 色。
常用的碱性染料有美兰、结晶紫、碱性复红、番红等。
四 操作步骤
㈠ 细菌的简单染色
涂片 1小滴生理盐水 干燥 室温或烘干 固定 2-3次 染色 美兰，2-3min 水洗 滤纸吸干 镜检
0.5 l 最小可分辨距离= ————
n sin q λ为所用光源波长；n=载玻片与物镜间介质的折射率。
镜口角是光线投射到物镜上的最大角度，q为物镜镜口角 半数，取决于物镜的直径和工作距离。
0.5 l 最小可分辨距离= ————
n sin q 显微镜数值孔径(numerical aperture, NA)：指镜口角一半 的正弦与载玻片物镜间介质折射率的乘积，是决定物镜性能的 最重要指标。
㈡ 显微镜使用及细菌基本形态观察
1 观察前准备 显微镜安置：置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验
台边沿约为10cm左右，镜检者姿势要端正。
光源调节：适当调节聚光器的高度可以改变视野亮度， 但是一般情况下聚光器在使用中都是调到最高位置。
聚光器数值孔径的调节：调节方法见教材，但是做普通 观察时可以不用调节。
二 实验器材
1 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。
2 溶液和试剂 香柏油、二甲苯、吕氏碱性美兰染液、水等。
3 仪器和其它用品 普通光学显微镜、载玻片、酒精灯、火柴、擦镜纸、接 种环、废液缸、滤纸、纱布等。
三 基本原理
转换器：是一个金属圆盘ห้องสมุดไป่ตู้上面装有3-4个物镜，可以使 物镜通过镜筒和目镜组成一个放大系统。
载物台：放置镜检标本，中间有 通光孔。载物台上装有标本夹和标本 推进器，在推动器上具有刻度，能够 确定标本位置，便于找到观察视野。
调焦装置： 调节物镜与标本间距 离的结构。
粗动螺旋
微动螺旋
2 光学系统
物镜：安装在转换器上，将物体第一次放大，决定显微镜 的成像质量和分辨能力。
六 实验报告
1 请绘制观察到的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌形态图。 2 什么是物镜的同焦现象？在显微观察时有什么意义？
Many Thanks
n：玻片与物镜间介质的折射率。
空气 (n=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油 (n=1.52)，介质折射率 提高 数值孔径值提高 分辨率提高。
2 提高照明度
空气(n=1.00) 玻璃(n=1.52)
光线在穿过折射率不同的介质 时发生折射。
对于低倍镜和高倍镜：介 质是空气
空气 (n=1.00) 玻璃 (n=1.52) 香柏油(n=1.52)