细胞培养工艺放大探讨
悬浮细胞培养生物反应器逐级放大工艺
悬浮细胞培养生物反应器逐级放大工艺是在生物制药和细胞培养领域中常用的方法，用于将细胞培养从实验室规模逐步放大到工业规模。
这个过程涉及到从小规模培养转移到大规模培养，确保细胞的生长和产物的产量都能得到有效控制。
以下是悬浮细胞培养生物反应器逐级放大工艺的一般步骤：1.实验室规模培养：在实验室中进行小规模的悬浮细胞培养，通常使用培养皿、培养瓶或小型生物反应器。
这一阶段用于研究细胞的生长特性、代谢产物的积累情况等。
2.初级放大阶段：在初级放大阶段，将实验室规模的细胞培养扩大到中等规模。
通常使用一些中型生物反应器或小型的生产级反应器。
在这个阶段，需要验证细胞培养的可行性和控制策略的有效性。
3.中级放大阶段：在中级放大阶段，将初级放大的细胞培养再次扩大。
通常使用大型生产级反应器，以更接近实际的生产条件。
在这个阶段，需要进一步优化培养条件，确保细胞的生长和产物的产量稳定和可控。
4.工业规模培养：在工业规模培养阶段，将中级放大的细胞培养再次扩大，以满足大规模产量的需求。
通常使用大型生产反应器，可能需要更加严格的生产控制和监测。
在这个阶段，需要确保细胞培养的一致性和稳定性。
在整个逐级放大的过程中，需要注意以下关键点：1.培养条件优化：在每个阶段，需要优化培养条件，包括温度、pH、氧气供应、营养物质等，以确保细胞的最佳生长和产物的产量。
2.工艺验证：在放大过程中，需要进行工艺验证，确保从小规模到大规模的转移不会影响细胞的生长性能和产物的质量。
3.监测和控制：在大规模培养中，需要建立有效的监测和控制策略，以保持培养的稳定性和一致性。
悬浮细胞培养生物反应器逐级放大工艺是一个复杂的过程，需要综合考虑多个因素，以确保细胞培养的成功和产物的高产。
动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
•
•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
CHO细胞克隆株放大培养与筛选2
CHO细胞克隆株放大培养与筛选2方案三细胞的悬浮驯化CHO-K1细胞的悬浮驯化及无血清培养1.取对数生长期的CHO-K1贴壁细胞，采用逐步降血清法将含10% FBS的F12培养基逐步替换为8%、5%、3%、2%、1%、0.5%FBS的F12培养基进行适应培养，每个血清浓度传代培养15~20次，使细胞在各血清浓度培养基里适应生长。
2.取适应0.5% FBS的F12低血清培养基培养条件的CHO-K1贴壁细胞，以5×105 cells/mL的密度接种到125 mL的三角细胞摇瓶中，逐步加入含有50%、70%、80%、90%、100% Sigma Ex-CELL CD CHO细胞培养基，37℃，5% CO2，100 rpm条件下进行培养液的逐步替代培养方案四三阶段悬浮驯化CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法_肖志华1.将CHO-K1细胞在含有10％FBS的F-12K培养基中培养，当细胞汇合度到70～80％时，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，以0 .4×105cells/ml的密度接种至10ml含10％FBS的F-12K培养基中传代，并观察细胞状态。
此阶段培养条件为37℃，体积分数为8％CO2培养箱，静止培养。
当细胞汇合度到70～80％，加胰酶消化并以同样的密度接种至10ml含5％FBS的F-12K培养基中。
培养两代后，用同样的方法将血清逐步降低至2.5％，培养3代，随着血清含量降低，起初细胞生长变慢，待细胞轮廓清晰、伸展状态良好之后，开始下一步降血清处理，通常细胞适应2-3代后，在血清降至2.5％之前，细胞都可以很快地扩增。
（阶段Ⅰ）2.条件培养基(Condition Medium，CM)制备：细胞在含有2 .5％FBS的F-12K培养基2-3天后，收集培养上清200g离心5分钟后，用0 .22μm的无菌滤膜过滤后待用。
3.细胞在含有2 .5％FBS的F-12K培养基中培养3代，细胞汇合度到70～80％时，用PBS洗两遍，加入胰酶消化，消化30秒后弃去胰酶，待细胞消化变圆以后，加入完全培养基（含血清）终止消化。
生物工艺放大解决方案手册
生物工艺放大解决方案手册全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：生物工艺放大是一种利用生物体系和技术来生产和加工产品的方法，它可以将生物体系中的微生物、酶、细胞等生物元素应用于工业生产领域，以实现高效、环保、可持续发展的生产方式。
在实践过程中，生物工艺放大可能会遇到一些挑战和问题，需要一份全面的解决方案手册来指导实践者如何解决这些问题。
本文将详细介绍生物工艺放大解决方案手册的制作内容和使用方法，希望能够帮助广大科研工作者更好地应用生物工艺放大技术。
一、生物工艺放大概述生物工艺放大是一种将实验室规模的生物反应器或工艺放大到工业规模的方法。
它可以应用于环境保护、食品加工、医药生产等领域，具有重要的应用价值。
生物工艺放大的主要过程包括微生物的培养、酶的提取、细胞的分离等，这些步骤都需要严格控制条件和参数，以确保生产过程的稳定性和高效性。
二、生物工艺放大的挑战与问题在实践中，生物工艺放大可能会遇到一些挑战和问题，主要包括以下几个方面：1. 微生物的选择和培养：不同的微生物对培养条件有不同的要求，需要根据具体情况选择适合的微生物，并优化培养条件，确保微生物的生长和代谢功能。
2. 酶的提取和纯化：酶的提取和纯化是生物工艺放大中的关键步骤，但这一过程复杂且易受污染，需要严密监控每一个环节，确保酶的活性和纯度。
3. 细胞的分离和培养：在细胞工程领域，细胞的分离和培养是一个关键问题，需要开发高效的分离和培养技术，以满足不同应用领域对细胞的要求。
4. 生产工艺的优化：生产工艺的优化是生物工艺放大中的关键问题，需要通过试验设计和数据分析，找到最优的生产条件，提高产品的产量和质量。
5. 安全环保：生物工艺放大涉及生物体系，存在一定的安全隐患，需要加强安全管理和环境保护，确保生产过程的安全和可持续发展。
三、生物工艺放大解决方案手册的制作内容为了帮助实践者更好地应用生物工艺放大技术，制作一份全面的解决方案手册是必不可少的。
生物工艺放大解决方案手册的制作内容主要包括以下几个方面：1. 生物工艺放大基础知识：手册应包括生物工艺放大的基础知识，包括微生物的培养、酶的提取、细胞的分离等基本概念和原理，帮助读者更好地理解生物工艺放大的工作原理。
CHO细胞培养生产抗体药物的工艺优化与放大研究工程
文献综述
CHO细胞大规模培养技术是近年来发展起来的真核细胞表达系统，被广泛应用 于单克隆抗体的生产。根据文献报道，影响CHO细胞大规模培养的主要因素包 括细胞培养基质、培养条件、细胞株选择和下游分离纯化工艺等。通过优化这 些因素，可有效提高CHO细胞培养的效率和单克隆抗体的产量。
研究方法
本研究采用CHO细胞系进行大规模培养，通过优化细胞培养基质、培养条件以 及下游分离纯化工艺，实现高效表达和纯化单克隆抗体。具体实验方法如下：
一、引言
乙肝疫苗是预防乙型肝炎病毒感染的重要手段。其中，重组CHO细胞乙肝疫苗 是一种高效、安全、易于生产的疫苗。然而，随着疫苗需求的不断增加，提高 生产效率和产品质量成为了亟待解决的问题。因此，本次演示将对重组CHO细 胞乙肝疫苗的生产工艺进行优化。
二、材料与方法
1、材料
重组CHO细胞乙肝疫苗生产所需材料包括CHO细胞、培养基、血清、胰蛋白酶、 葡萄糖、谷氨酰胺等。
参考内容二
摘要
本次演示旨在探讨重组CHO细胞乙肝疫苗生产工艺的优化。通过对现有生产工 艺的分析和研究，我们提出了一系列工艺优化方案，并对其进行了实验验证。 实验结果表明，优化后的生产工艺显著提高了乙肝疫苗的生产效率和产品质量。
关键词：重组CHO细胞乙肝疫苗， 生产工艺，优化
This article aims to explore the optimization of production process for recombinant CHO cell hepatitis B vaccine. Through the analysis and research of existing production processes, we propose a series of process optimization plans and experimentally verify them. The experimental results show that the optimized production proces
生物制药技术中的细胞培养与放大工艺优化策略
生物制药技术中的细胞培养与放大工艺优化策略细胞培养与放大是生物制药技术中至关重要的工艺环节，它涉及到细胞的生长、繁殖和产物的积累。
研究并优化细胞培养与放大工艺对于提高生物制药产品的质量和产量具有重要意义。
本文将探讨细胞培养与放大工艺中常见的优化策略，并介绍一些有效的方法和技术。
1. 细胞株的选择和改进细胞株的选择是优化细胞培养与放大工艺的关键步骤。
在生物制药中，常用的细胞株包括哺乳动物细胞、细菌和真菌等。
选择适合生产目的的细胞株是至关重要的，因为不同细胞株对培养条件的要求不同。
同时，通过基因工程技术改良细胞株，可以提高产物的表达水平和稳定性。
2. 培养基的优化培养基是支持细胞生长和产物积累的基础。
优化培养基中的营养物质、气体成分和pH值等因素，可以提高细胞生长速度和产物的质量。
此外，添加生长因子、激素或其他辅助物质，也可以促进细胞的增殖和产物的积累。
3. 培养条件的控制培养条件的控制对于细胞培养与放大的成功至关重要。
包括温度、湿度、气体浓度和混合速度等因素都会影响细胞的生长和产物的质量。
因此，通过精确控制这些参数，可以调节细胞的代谢活性和产物的积累，从而提高生物制药产品的质量和产量。
4. 搅拌和通气策略搅拌和通气是细胞培养过程中重要的工艺步骤。
适当的搅拌可以保持培养基的均匀性，防止细胞沉降和产物沉积。
而充足的通气则可以提供细胞所需的氧气和二氧化碳的排出。
通过优化搅拌和通气策略，可以提高细胞的生长速度和产物的积累。
5. 反式激活剂和代谢物调控生物制药产品的产物主要来源于细胞内的代谢途径。
通过添加适当的反式激活剂或调节代谢物的浓度，可以调控细胞的代谢途径和产物的积累。
这对于提高产品的纯度和产量非常重要。
6. 细胞的生长激素和应激蛋白调控细胞的生长激素和应激蛋白是调控细胞生长和代谢的重要因素。
通过添加适当的生长激素或应激蛋白，可以促进细胞的生长和产物的积累。
这些调节因子可以通过基因工程技术来引入细胞中，从而提高细胞的生长速度和产物的表达水平。
14 制药工艺放大研究
2011-2-19
等，可根据反应特点来选定。
24
4. 反应条件的优化
必要性：实验室获得的最佳反应条件不一定能完 全符合中试放大要求 优化主要因素：如 放热反应的加料速度、
搅拌效率、 反应罐的传热面积与传热系数、 制冷剂等 进行深入研究，掌握其在中试装置中的变化规律，得到 更为合适的反应条件。 如： 加料，改一次投料为分次投料 降温，用冷冻盐水、5℃水
2
第二十三章 制药工艺放大研究
中试放大的概念及影响因素 中试放大的研究方法 中试的研究内容 制定生产工艺规程
中南大学制药工程系
2011-2-19
3
第一节 概述
一、中试放大的概念
概念
中试放大(scale-up)：把实验室小试研究确定的工艺路线 与条件，在中试工厂(车间)进行的试验研究。
规模
一般在实验室规模上放大50 ~100倍； 对于细胞培养，通常采用10~30L以上反应器进行放大研 究。采用吨级发酵罐进行中试，更为有利； 也可结合药物的制剂规格、剂型及临床使用情况确定中 试放大规模
3.中试一般设备
l0L、50L、100L、200L、500L反应器、高压釜 配套20L高真空蒸馏装置、真空泵、水冲泵、 高位槽、储罐 蒸汽管、冷冻管 分离罐、离心机、板框过滤机、粉碎机 双锥干燥器、烘箱
中南大学制药工程系
2011-2-19 19
二、研究内容
1. 生产工艺路线的复审 2. 设备材质及型式的选择 3. 搅拌型式及搅拌速度的考察 4. 反应条件的优化 5. 工艺流程和操作方法的确定 6. 安全生产与“三废”防治措施的研究 7. 原辅材料和中间体的质量监控 8. 消耗定额、原料成本、操作工时、生产周期 的计算
细胞培养放大指南
表3 康宁聚苯乙烯滚瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量
康宁滚瓶
490 cm2 滚瓶 850 cm2 滚瓶 1700 cm2 滚瓶 1750 cm2 滚瓶
平均细胞产量 4.9x107 8.5x107 1.7x108 1.75x108
*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x105 个细胞。
培养液用量 100-150 mL 170- 255 mL 340- 510mL 350- 525 mL
图 3：Corning®T-225大培养瓶为 培养大量细胞提供了更加简单实 用的方法。
优点 可替代培养瓶，并且简单经济 可直接接触细胞表面，易于收集（采用刮取方式收集时尤为突出） 比培养瓶占用的培养箱空间小 可利用显微镜迅速判定细胞生长情况 无需其它设备
缺点 培养量大时工作量大：培养1 x 109 个细胞需20500平方厘米的培养皿
优点 传统技术，方便使用 方便使用移液管，便于细胞的加液和采集。 可利用显微镜迅速判定细胞生长情况 减少培养液外溢及培养过程的污染 无需其它设备
缺点 培养量大时工作强度较高：培养 1 x 109 个细胞时需要44个 T-225 培养瓶
（图3） 占用培养箱空间较多
单个培养瓶
多个培养瓶 冷冻保
存管 图2：康宁提供的适用于贴壁细胞和悬浮细胞培养的放大系统。
1.5 x 107
175 cm2
1.75 x 107
225 cm2
2.25 x 107
*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x105 个细胞。
培养液
用量
5 - 7.5 mL 15 - 22.5 mL
30- 45 mL 35 -52.5 mL 45 - 67.5 mL
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气体分布器
µ-sparger ring sparger Combination
反应器设计特点- 通气模式
Ex. gassing strategy BIOSTAT B
Ex. gassing strategy BIOSTAT STR
Develop at small scale, transfer easily to large scale
中试规模 50L, 200L, 2000L
生产规模 5000L, 40000L
工艺放大-影响因素
生物因素 传代次数 突变概率 易污染 易聚集 筛选压力 化学因素 pH调节试剂 培养基质量 工艺水质量 碳水化合物（糖）浓度 氮源浓度 磷酸盐浓度 表面张力引起的泡沫 物理因素 罐体外形 通气 搅拌 培养基灭菌 温度控制 混合
addition of phosphate buffer
Decolourisation method
31/10/2012
Mixing time
STR 1000
STR 500
STR 200 STR 50
Mixing time comparison of 4 different bioreactors
Small scale Benchtop Pilot/Production
BIOSTAT STR 50 -1000 -2000 L WV BIOSTAT RM 1 -300 L WV Univessel SU 2 - 10 L WV
Small Scale Benchtop Pilot/Production
3
200
500
1000
Calculation Stirrer speed: Power input = constant
Calculation Stirrer speed: Power input = constant
Mixing Time Determination
Conductivity method
Power input determination by Newton number
Ne
2 M 5 l n 2 d 2
measurement of torque Torque transducer, max. 10 Nm (ETH-Messtechnik)
Measurement in RO-water
OTRmax = 1.5 mmol/L-hr
kLa (air)
≈ 7 [1/h]
kLa-value – from glass to single use
Max filling, 0,1vvm 1 x PBS, 37 °C, gassing-out method
35 30
UniVessel 5L UniVessel 1L UniVessel 10L
- 评估一次性搅拌式反应器在XD®工艺中的稳定性、 材料 - Cells: 生产单克隆抗体的CHO 细胞株 - Retention device: 中空纤维装置, ie. ATF module company Refine - Feed: 连续灌注补料新鲜培养液 - Bioreactor: BIOSTAT® STR, wv 50L & 200L - Cultivation modus: T 36.5°C, DO 50%, pH between 7.36.8, pCO2 < 15 kPA - µsparger 150 µm - 6blade 底部/ 3blade 顶部 - 一次性的出气滤器冷凝器提高了出气滤器的安全性
500,00
600,00
700,00
800,00
900,00
1000,00
IVC
实例3：5L玻璃罐到STR50L的工艺放大
国内某客户 细胞株：CHO
培养工艺：Fed-Batch
赛多利斯生物反应器预览– 反应器市场的领导者
BIOSTAT D DCU 10 - 200 L WV BIOSTAT Cplus 2 -30 L WV Engineering Platform BIOSTAT Qplus – B-DCU II 0,5 -10 L WV
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
14,00
Time (days)
200L XD
12,00
2L P23037
10,00
Titer (g/L)
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00 0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
25 20
STR 1000 STR 500
kLa [1/h]
20 15 10 5
kLa [1/h]
25
15 10 5
UniVessel 2L
STR 200
STR 50 0 0.6 1.2 1.8 2.4
0
0 0.6 1.2 1.8 2.4
0
Tip Speed [m/s]
Tip Speed [m/s]
E-mail：@ Hot-line：400 920 9889 | 800 820 9889
官方微博： 赛多利斯 Sartorius China
官方微信： 赛多利斯斯泰迪
23/06/2014
Seite 31
3 2 1 130 240 1,8 54 0,42 tbd
200
1.5
1.8
143
1.8
225
1.8
310
1.8
379
0.39
186
0.38
300
0.38
403
0.38
493
Distance between impellers
Liquid height HL(mm) Ratio HL/d1
470
1.27
Power input per volume (P/V) - from Univessel 2L to STR 1000L
Univessel SU 2L
100 90
Power input per volume [W/m ]
50
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Tip speed [m/s] 1,4 1,6 1,8 2,0
783
1.34
1005
1.23
1360
1.36
1670
1.29
Page 3
反应器设计特点- 桨叶及气体分布器
桨叶设计
2 x 6blade disk impeller 2 x 3blade segment impeller upwards mixing
2 x 3blade segment impeller downwards mixing
Chaubard et al., BioPharm International, Nov. 2, 2010
OUR vs OTR (kla)
Source:
“For A-Mab the maximum OUR was estimated to be 1.5 mmol/L-hr at 15 × 106 cells/mL”.
反应器硬件设计相关： • 几何相似性
•
• •
搅ห้องสมุดไป่ตู้桨设计
通气策略 搅拌桨叶线速度
培养工艺参数相关：
•
•
单位体积功率输入值(P/V)
kLa-值
反应器设计特点- 几何相似性
Vessel total volume [L] max. working volume [L] min. working volume [L] vessel diameter d1 [mm] vessel height h [mm] ratio h/dv impeller diameter 3-blade di2 [mm] ratio di/dv (3-blade) UniVessel 2L BIOSTAT STR 50L 70 50 12.5 370 666 BIOSTAT STR 200L 280 200 50 585 1055 BIOSTAT STR 500L 700 500 125 815 1467 BIOSTAT STR 1000L 1300 1000 250 997 1800 BIOSTAT STR 2000L 2800 2000 500 1295 2330 1.8 492 0.38 492
细胞培养工艺放大核心
“混合和传质”
• 液质混合/ 剪切力 搅拌 • 传氧 / CO2 去除 通气
经验与工程参数在放大中起到同样重要的作用
Impeller Tip Speed
Tip d 2 n
STR 50 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0.6 1.2
细胞培养工艺放大探讨
刘家英 产品应用支持
赛多利斯中国
目录
工艺放大定义及目标 反应器硬件设计需求及工艺控制参数 应用实例
目录
工艺放大定义及目标 反应器硬件设计需求及工艺控制参数 应用实例
工艺放大-将工艺从实验室规模转移至大规模反应器 实验室规模
摇瓶， 转瓶， 1-20L反应器
工艺放大的目标
设备相关 确认和控制主 要的参数以及 操作空间
制剂相关 确认和控制主 要的成分以及 变量
生产和工艺相关 开发、评估和验证 工艺步骤和控制手 段
文件相关
根据法规要求 记录和报告
目录
工艺放大定义及目标 反应器硬件设计需求及工艺控制参数 应用实例