普通PCR设计引物应遵循以下原则
PCR影响因素
影响PＣR 结果得因素(１) 引物: 引物就是PCＲ特异性反应得关键,ＰＣＲ产物得特异性取决于引物与模板DＮA 互补得程度、设计引物应遵循以下原则:①引物长度: 1５-30bp,常用为20ｂp左右。
②引物扩增跨度: 以200－500ｂｐ为宜,特定条件下可扩增长至10kｂ得片段。
③引物碱基:G＋Ｃ含量以40—60％为宜,G+Ｃ太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3＇端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带。
⑤引物3'端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适得酶切位点, 被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性、引物量:每条引物得浓度０、1～1ｕmｏl或1０～1００pmoｌ,以最低引物量产生所需要得结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会。
(2)酶及其浓度目前有两种TaｑDNＡ聚合酶供应, 一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶,另一种为大肠菌合成得基因工程酶、催化一典型得PCR反应约需酶量２。
5Ｕ(指总反应体积为10０ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
(3)dNTP得质量与浓度dNTP得质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系,dＮTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
ｄNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以１M NaOH 或１M Tris、HCL得缓冲液将其PH调节到7。
0～７.5,小量分装, —２0℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCＲ反应中,dNTP应为50~２00ｕmｏl／L,尤其就是注意４种ｄNT Ｐ得浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配、浓度过低又会降低PCＲ产物得产量、dＮTP能与Mg2+结合,使游离得Ｍｇ２+浓度降低。
设计pcr引物遵循的原则
设计pcr引物遵循的原则聚合酶链反应（PCR）引物的设计是PCR实验成功的关键因素之一。
以下是一些设计PCR引物时应遵循的原则：1. 特异性：引物应具有高度特异性，以确保它们只与目标DNA序列结合，而不与其他非目标序列结合。
这有助于避免非特异性扩增产物的形成。
2. 长度：引物的长度通常应在18到25个碱基对之间，过长或过短的引物可能导致扩增效率降低。
引物长度的一般建议是20-22个碱基对。
3. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
这有助于确保引物的熔解温度适中，提高引物的特异性。
4. 熔解温度（Tm）：引物的Tm是引物与模板DNA结合和解离的温度。
引物的Tm应该在50-65°C之间，以确保在PCR循环中引物能够特异性结合到模板。
5. 避免自相互或异相互二聚体：引物的设计应防止引物之间或引物与模板之间发生意外的二聚体形成，这可能导致PCR反应的不稳定性。
可以使用在线工具预测引物之间和引物与模板之间的二聚体。
6. 避免重复序列：引物应避免含有重复序列，以防止非特异性扩增。
7. 避免剪切位点：引物不应该包含酶切位点，以防止在PCR扩增过程中被酶切。
8. 引物对的选择：在PCR反应中，通常需要一对引物。
这对引物应该相互配合，以确保它们在同一温度下工作，并且扩增产物大小符合实验要求。
9. 考虑引物的位置：引物应设计在目标序列内部，而不是在末端。
这有助于确保扩增产物包含目标区域的完整信息。
10. 检查SNP和突变：引物的设计需要考虑可能存在的单核苷酸多态性（SNP）或突变。
确保引物能够区分目标序列中的变异。
在进行PCR引物设计时，通常使用一些在线工具或软件来辅助，这些工具可以帮助评估引物的特异性和其他参数。
PCR引物设计的原则
PCR引物设计的原则引物设计的原则:首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。
如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。
但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的基础技术，可以在体外复制DNA分子。
PCR的核心是引物，引物的设计质量直接影响PCR反应的效率和特异性。
以下是PCR引物设计的原则。
1.引物长度：引物的理想长度为18-22个碱基对。
引物过短可能导致特异性不足，引物过长则可能降低PCR的效率。
2.引物序列：引物序列应具备良好的互补性，即能与待扩增的目标DNA序列特异性结合。
通常，引物的GC含量应在40-60%之间，以确保引物和目标序列之间形成稳定的氢键。
3.引物选择：引物的设计需要仔细考虑避免引物间以及引物与模板序列间的互补。
如果引物之间有互补性，则可能导致非特异性扩增。
另外，引物不能与附近的肥皂序列或重复序列互补，以免引入非特异性产物。
4.引物结构：引物的3'端应以碱基对为基础设计，以提高扩增特异性。
同时，避免引物在末端出现重复序列，以免引导多聚加合反应。
5.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应相似，并在50-60℃之间，以确保引物和模板序列的互补结合，同时避免引物之间的自身结合。
6.引物的位点选择：引物应选择在目标序列上的保守区域，以确保引物在不同基因型和物种之间的通用性。
在选择引物位点时，避免选择在引物附近有大量SNP（单核苷酸多态性）或缺失突变的区域。
7.引物的杂合性别：引物的杂合性别是指引物本身的互补性。
如果引物存在杂合性别，则可能导致非特异性扩增。
在进行引物设计时，可以使用软件工具来评估引物的可能杂合效应。
8.引物的特异性评估：在进行引物设计后，可以使用BLAST等工具来评估引物的特异性。
该工具可以引物序列与数据库中的其他序列的互补匹配。
特异性较好的引物应仅与目标序列匹配。
9.引物标记：引物可以通过添加特定序列或化学标记进行标记。
在PCR扩增过程中，通过标记引物可以进行定量和检测反应产物的操作。
在PCR实验中，良好的引物设计是确保特异性扩增的关键。
引物设计需要综合考虑引物长度、序列、选择、结构、熔解温度、位点选择、杂合性别、特异性评估、标记和固定等因素。
普通pcr引物设计方法
普通pcr引物设计方法摘要：一、引言二、PCR引物概述1.PCR引物的定义2.PCR引物的作用3.PCR引物的分类三、普通PCR引物设计方法1.设计原则1) 引物长度2) 引物Tm值3) 引物间的互补性4) 引物与模板的互补性2.设计步骤1) 确定目标序列2) 查找引物设计软件3) 输入参数并进行引物设计4) 评估引物性能5) 优化引物四、常用引物设计软件介绍1.Primer 32.NP_Primer3.Oligo4.PyroMark Assay Design五、引物筛选与优化1.引物筛选1) 引物扩增效率2) 引物特异性2.引物优化1) 引物长度和Tm值优化2) 引物碱基序列优化六、总结与展望正文：一、引言PCR技术自1983年被发明以来，已成为分子生物学研究中不可或缺的工具。
PCR引物是PCR反应的核心组成部分，其设计直接影响到PCR扩增效果。
本文将介绍普通PCR引物设计方法，以指导科研人员和技术人员高效地进行PCR实验。
二、PCR引物概述1.PCR引物的定义PCR引物是一对短的DNA片段，分别与目标序列的两端互补，引导DNA 聚合酶在目标序列上进行扩增。
2.PCR引物的作用PCR引物的作用主要有两点：一是引导DNA聚合酶在特定位置开始扩增；二是使扩增产物具有特定的序列。
3.PCR引物的分类根据引物长度和碱基序列，PCR引物可分为常规引物和巢式引物。
三、普通PCR引物设计方法1.设计原则（1）引物长度：通常为18-25个碱基对，过长的引物可能导致扩增效率降低。
（2）引物Tm值：理想的Tm值约为50-65℃，过高或过低的Tm值都会影响引物扩增效果。
（3）引物间的互补性：引物之间应避免互补，以免发生非特异性扩增。
（4）引物与模板的互补性：引物应与目标序列具有较强的互补性，以确保扩增效率。
2.设计步骤（1）确定目标序列：根据研究需求，选取需要扩增的目标序列。
（2）查找引物设计软件：市面上有很多引物设计软件，如Primer 3、NP_Primer、Oligo等。
PCR引物设计的基本原则
PCR引物设计的基本原则1. 引物的长度一般取15-30bp，常用18-27bp，但不能大于38bp，因为引物过长会导致其延伸温度大于74℃。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也很可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。
如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。
4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好处于72℃左右。
（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55-80℃之间5. ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。
一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此可防止错误引发。
3′末端双链的ΔG是0~-2 kcal/mol时，PCR产量几乎到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于0。
6.错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但是对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。
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普通P C R设计引物应
遵循以下原则
-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
一设计引物应遵循以下原则
1 、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2 、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3 、引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
上下游引物的GC 含量不能相差太大。
附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃，设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。
但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6 、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。
7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
8 、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR 体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。
酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。
9 、设计软件：最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
二引物保存
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。
TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
三各种PCR的引物设计
1、长距离PCR：
标准PCR的扩增长度在1～2kb间，不能满足中大型基因的扩增。
在此背景下产生了长距离PCR。
其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:
a 、长度一般在25～30bp间；b、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。
如果两条引物的解链温度的差异大于1度，就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。
2、反相PCR：
标准PCR应用于已知片断的扩增。
而反相PCR应用于扩增已知片断相邻的未知片断，主要应用于a，产生探针；b，从总RNA中克隆未知cDNA序列；c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列。
其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外，其它同标准原则。
3、差异显示PCR（DD-PCR）:
次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA，通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。
其引物有两套，一为锚定引物，一为随机引物。
锚定引物是由12个不同引物组成的库，序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任一个，Y可以是ATGC中的任一个。
随机引物是由15个不同的，长度为10mer的引物组成。
它们的序列都是随机形成的，都应改包含几乎相等的四种单核苷酸，G与C 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结构的倾向。
4、多重PCR:
多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断，以节省模板、节约时间和减少费用。
引物设计在遵守标准PCR引物设计的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度，引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。
5、热启动PCR
6、降落PCR
这两种PCR只是为了满足特别要求，在标准PCR的基础上进行了一些方法上的改进，而对引物没有什么特殊的要求，按照标准PCR的引物设计原则即可。