布鲁氏菌实验室检验
布鲁氏菌病诊断的金标准
布鲁氏菌病诊断的金标准
布鲁氏菌病的金标准诊断方法是通过分离和鉴定布鲁氏菌。
具体诊断布鲁氏菌病的步骤包括：
1. 临床症状分析：布鲁氏菌病的典型症状包括发热、关节痛、乏力、头痛等，临床医生根据患者的症状进行初步判断。
2. 实验室检查：通过采集患者的血液、骨髓、尿液、淋巴组织或其他体液或组织进行培养。
3. 分离布鲁氏菌：将采集到的样本进行无菌条件下的培养处理，将培养基上的菌落进行进一步的鉴定。
4. 鉴定布鲁氏菌：通过对分离的菌落进行生理生化试验，如氧化酶试验、嗜碱性试验、免疫荧光试验、PCR等，判断菌株
是否为布鲁氏菌。
金标准诊断布鲁氏菌病的主要依据是从患者体液或组织样本中成功分离和鉴定出布鲁氏菌。
但由于布鲁氏菌的培养和鉴定过程较为复杂，诊断通常需要时间，并且技术要求高，因此常常需要结合临床症状、实验室检查及其他辅助诊断方法来综合判断。
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展高明华樊庆德徐春光杨晓刚（呼伦贝尔学院生命科学与化学学院内蒙古呼伦贝尔021008）布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要人兽共患病。
根据致病性和宿主特异性，将布鲁氏菌分为6个种19个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.meltensis)、牛种布鲁氏菌(B. abortus)、猪种布鲁氏菌(B. suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、犬种布鲁氏菌(B. canis)和沙林鼠种布鲁氏菌(B. neotomae)。
另外，从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的布鲁氏菌，定为海洋种布鲁氏菌(B. maris)。
据CDC报告，我国人布鲁氏菌病发生严重，2005~2007年全国布鲁氏菌病新发病人分别为18 416、19 013、21 901例，2008年1~10月新发病数已达27 264例，形势十分严峻。
流行病学调查表明，感染来源主要是患布鲁氏菌病的羊，其次是牛及其他动物。
并且具有疫区范围扩大、爆发点增多、典型病例增多、人群分布以农民和牧民为主等特点。
为有效预防和控制人和动物布鲁氏菌病，加强对动物布鲁氏菌病的检疫监测力度十分重要。
为此本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展作以综述。
1 免疫学诊断技术1.1 血清凝集性试验布鲁氏菌病传统检测方法有血清凝集试验、全乳环状试验(MRT)和抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)等。
经典血清凝集试验包括标准试管凝集试验(SAT)和平板凝集试验(PAT)等在发达国家已基本上停止使用，取代方法是缓冲布鲁氏菌抗原试验，如虎红平板凝集试验(RBT)等。
在国际贸易中，缓冲布鲁氏菌抗原试验是牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定试验。
乳牛MRT依然是乳牛布鲁氏菌病监测的主要方法。
由于凝集性试验是基于检测针对布鲁氏菌多糖O-链的抗体，因此会与有类似多糖O-链的细菌如耶尔森氏菌O:9等出现交叉反应。
1.2 补体结合试验（CFT）CFT至今仍是布鲁氏菌病诊断的重要方法，是牛、羊及绵羊附睾种布鲁氏菌病国际贸易指定试验，并作为确诊用。
布病检查项目
布病检查项目
布病即布鲁氏菌病，是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病。
为了确诊布鲁氏菌病，需要进行一系列检查，主要包括以下几个方面：
1.常规实验室检查：包括全血细胞计数、血沉、肝酶等。
这些检查可以帮助医生了解患者的身体状况和病情。
2.病原学检查：这是确诊布鲁氏菌病的重要手段。
通过采集患者的血液、骨髓、关节液、脑脊液、尿液、淋巴组织等标本，进行培养和分离，如果找到了布鲁氏菌，即可确诊。
3.免疫学检查：包括平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、布病抗-人免疫球蛋白试验等。
这些检查可以帮助医生了解患者的免疫反应和病情，并对患者进行诊断和鉴别诊断。
4.其他特殊检查：如果医生怀疑患者出现了心脏、神经系统等并发症，会根据具体情况安排相应的特殊检查，如超声心动图、心电图、腰椎穿刺等。
需要注意的是，不同的医疗机构和实验室可能会有不同的检查项目和方法，具体的检查流程和注意事项需要听从医生的建议。
同时，如果出现布鲁氏菌病的可疑症状，应及时就医并告知医生自己的接触史和旅行史等。
布鲁氏菌病的实验室检查
布病简介
牛种
绵羊附睾种 Brucella
沙林鼠种
犬种
羊种 猪种
布病血清学诊断
标本的采集、保存及运输
1） 血清学诊断需要的标本类型为人及疑似动物 血清。
2） 使用负压采血管或注射器进行采集。 3） 分离到的血清存放到灭菌后的血清管内。 4） 两周内进行实验的血清可4℃冷藏保存。
• 检测试剂需使用R型布鲁氏菌虎红平板凝集抗原。
• 在条件允许的情况下，建议虎红平板凝集抗原 （检测S型布鲁氏菌抗体的虎红平板凝集抗原）和 R型布鲁氏菌虎红平板凝集抗原同时进行检测。
• 器材
试管凝集实验
小试管 试管架 诊断试剂
• 器材
试管凝集实验
加样枪
吸头吸头
操作方法
• 每份血清取6-8支小试管，放于试管架上。 • 血清稀释：第一管加入960ul生理盐水，其余各管
内，放到37℃温箱内培养。
运送
• 采集到的双相血培养瓶尽快送至贵州省疾病预防 控制中心布病实验室，进行培养检测，检测结果 会在一个半月内反馈至县疾控中心。
• 血培养瓶的运输，不需要冷藏，常温运输。
谢 谢！
• 每个方格内加入布病虎红平板凝集抗原30ul，备 检血清30ul。 注意：虎红平板凝集抗原使用前需充分摇匀。
• 使用牙签将两者混匀。 • 旋转摆动玻璃平板，室温5分钟之内观察结果。 • 每个平板需做阴、阳性血清对照，方法同备检血
清。
结果判断
阳性 阴阳性血清对照同时成立，本次实验成立。
阴性
• 因犬种布鲁氏菌为天然粗糙型，所以产生的血清 抗体为粗糙型布鲁氏菌血清抗体。
血清的反复冻融会引起布病抗体效价的降低 5） 检测后的血清-25℃冷冻保存。 6） 使用冷藏箱进行长距离运输。 注意：采集血清需使用红色或者黄色盖子的负压采
2023布鲁氏菌的实验室检查
2023布鲁民菌的实验室检查布鲁氏菌可以引起人畜共患疾病布鲁氏菌病，简称”布病气世界动物卫生组织将该病规定为强制报告的疫病，我国将真列为二类动物疫病。
人类布鲁氏菌病在我国属于法定乙类传染病。
布鲁氏菌的致病性与侵袭力、致敏原、内毒素和在巨噬细胞中的生存力有关。
主要致病因子是内毒素。
布鲁氏菌具有致敏性，该菌进入集体，除诱发机体产生各种类型抗体外，还可刺湖几体产生明显过敏反应，过敏反应是布病的重要致病机制之一。
一、｜｜备床表现人类布病一般潜伏期为1～3周，平均为2周。
个别病例潜伏期可长达1年。
目前多数病例发病缓慢，少数起病急骤，一般类似感冒。
布病患者最常出现的症状是发热，典型的波浪式起伏发热。
目前临床上多为低热，间歇热等。
同发热泪伴的症状是多汗，一般在晚上增多，出现盗汗，汗质较黠。
另一个常见的症状是关节肌肉痛，在急性期常呈游走性，主要在大关节，慢性期疼痛局限于大关节。
真他症状和体征高乏力、精神不振、皮摩、肝脾淋巴肿大、皇丸肿大、关节肿大、皮下结节出现等。
二、流行病学特征人类布菌病的主要传染源是羊、牛、猪等，羊是人类布病最危险的传染源，牛是人群布病散发的主要传染源。
野生动物也可作为传染源，野生动物的布病感染是在自然疫源地内的野生动物之间相E传播，高的感染还和家畜再关。
人对布鲁氏菌普遍易感，通过皮肤接触、消化道、呼吸道侵入机体。
人感染途径与职业、生活习惯相关，苟明显的职业性。
实验室人员主要以呼吸道感染为主。
我国自1905年来，累计已高29个省市区报告过布病，多见于我国东北、西北和内蒙的牧区。
三、防治原则布病的防治重点是控制和消灭病畜。
采取M检疫、免疫、捕杀病畜”三结合的综合性防治擂施，通过加强对畜牧产晶的卫生监督控制布病的传染源，切断真传播途径；通过对易感人群和健康家畜接种疫苗预防布病的发生。
急性患者采用抗生素治疗，慢性期患者可采用特异性疫苗脱敏治疗。
四、生物学特征布鲁氏菌是革兰氏阴性球杆菌，柯氏染色呈红色，无鞭毛，无芽抱，不形成英膜。
布鲁氏菌实验室检测
S:5`- GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3` ⑸ IS711-specific primer ：
IS:5`- TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3`
全血玻片凝集反应在一张清洁的破片上加1滴赫德逊氏反应抗原然后在抗原上加1滴受检血液或关节腔内积液可用加样器吸头使其混匀在酒精灯上稍微加热促进反应在8分钟内观察结果凡在此时间内出现凝集者为阳性
布鲁氏菌实验室检测
微生物室 2013年8月 蚌埠
1、布鲁氏菌分离培养（抗原） 2、布病血清学检测（抗体） 3、分子生物学分型方法（菌株分型） 4、实验室生物安全和质量控制
种水平的鉴定(AMOS-PCR)
⑴ B. abortus-specific priTTTTCCAATCCC-3` ⑵ B. melitensis-specific primer ：
M: 5`- AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA ⑶ B. ovis-specific primer ：
扩增条件： 25ul 反应体系：水，16.9ul；10*buffer, 2.5ul；dNTPs （2,5ML）, 2ul; A,M,O,S引物（10mM）, 各0.4ul；IS引
物（10mM）,0.8ul； DNA（30ng）, 1ul；Taq 1u （5U/ul ，0.2ul）。
反应条件： 95℃ 5分钟； 95℃ 30秒，56℃ 45秒，72℃, 1分钟； 28个循环； 72℃ 5 分钟。
a:BSL-3， b:BSL-2，c: BSL-1
质量控制
耗材（小试管） 试剂（下发） 对照（阳性、阴性） 温度 考核
布鲁氏菌病检测技术
样品处理方法与注意事项
处理方法
包括样品的保存、运输、分离和培养 等步骤，应严格按照操作规程进行， 以确保检测结果的准确性。
注意事项
在处理过程中，应注意防止样品的污 染和变质，避免影响检测结果。同时 ，还应注意个人防护，防止交叉感染 。
避免交叉污染和误操作措施
80%
严格分区操作
在样品处理过程中，应设置清洁 区、半污染区和污染区，并严格 分区操作，以避免交叉污染。
危害程度
布鲁氏菌病不仅危害人类健康，还影响畜牧业的发展，造成 严重的经济损失。同时，该病也是一种潜在的生物恐怖袭击 的病原体，对国家安全具有威胁。
流行病学特点及分布
流行病学特点
布鲁氏菌病在流行病学上表现为散发性和地方性流行，与家畜的饲养和畜产品 加工密切相关。人群对布鲁氏菌普遍易感，青壮年男性由于职业关系，其发病 率高于女性。
08
总结回顾与未来发展趋势
本次项目成果总结
成功研发出高灵敏度的布鲁氏菌病检测方法
通过优化反应条件和引物设计，提高了检测方法的灵敏度和特异性，为布鲁氏菌病的早 期诊断和治疗提供了有力支持。
建立了完善的布鲁氏菌病检测流程
从样本采集、处理到检测结果的解读和报告，建立了一套完善的检测流程，确保了检测 结果的准确性和可靠性。
03
专业技术人员不足
布鲁氏菌病检测需要专业的技术人员 进行操作和解读，但目前相关领域的 专业技术人员仍显不足，需要加强人 才培养和引进。
未来发展趋势预测
检测技术将更加智 能化和自动化
随着科技的不断发展，未来布 鲁氏菌病检测技术将更加智能 化和自动化，提高检测效率和 准确性。
多技术联合应用将 成为趋势
暗视野显微镜
利用特殊的光学原理，在暗背 景下观察发亮的细菌，提高检 测灵敏度。
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展百替生物
布鲁氏菌病实验室诊断研究进展高明华 樊庆德 徐春光 杨晓刚（呼伦贝尔学院生命科学与化学学院 内蒙古 呼伦贝尔 021008）布鲁氏菌病(Brucellosis )是由布鲁氏菌(Brucella )引起的一种重要人兽共患病。
根据致病性和宿主特异性，将布鲁氏菌分为 6个种19个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.meltensis )、牛种布鲁氏菌(B.abortus )、猪种布鲁氏菌(B. suis )、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis )、犬种布鲁氏菌(B. canis ) 和沙林鼠种布鲁氏菌(B. neotomae )。
另外，从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的布鲁氏菌，定为海洋种布鲁氏菌(B. maris )。
据CDC 报告，我国人布鲁氏菌病发生严重，2005~2007年全国布鲁氏菌病新发病人分别为18 416、19 013、21 901例，2008年1~10月新发病数已达27 264例，形势十分严峻。
流行病学调查表明，感染来源主要是患布鲁氏菌病的羊，其次是牛及其他动物。
并且具有疫区范围扩大、爆发点增多、典型病例增多、人群分布以农民和牧民为主等特点。
为有效预防和控制人和动物布鲁氏菌病，加强对动物布鲁氏菌病的检疫监测力度十分重要。
为此本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展作以综述。
1 免疫学诊断技术 1.1 血清凝集性试验布鲁氏菌病传统检测方法有血清凝集试验、全乳环状试验(MRT)和抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)等。
经典血清凝集试验包括标准试管凝集试验(SAT)和平板凝集试验(PAT)等在发达国家已基本上停止使用，取代方法是缓冲布鲁氏菌抗原试验，如虎红平板凝集试验(RBT)等。
在国际贸易中，缓冲布鲁氏菌抗原试验是牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定试验。
乳牛MRT 依然是乳牛布鲁氏菌病监测的主要方法。
由于凝集性试验是基于检测针对布鲁氏菌多糖O-链的抗体，因此会与有类似多糖O-链的细菌如耶尔森氏菌O:9等出现交叉反应。
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药物名称 漂白粉
红汞 过锰酸钾 甲醛 乳酸 氢氧化钾 肥皂
浓度(%) 0.2～2.5
2 0.1～0.2 0.2 0.5
2 2
生存时间 2分钟以内 7分钟 7～15分钟 20分钟以上 1分钟以内 3分钟 20分钟以上
主要化学药品对三型菌的影响
──────────────────
化学药品名称
浓度 布鲁氏菌生存时间(分钟)
涂片染色检查多为单个排列，少见成对 短链排列。
布鲁氏菌可被碱性染料着色； 革兰染色阴性； 柯兹罗夫斯基提出用0.5%沙黄水溶液染
色，加热出现气泡，水洗后用0.5%孔雀 绿或1%美兰复染，布鲁氏菌呈红色，其 它细菌呈绿色和兰色。
布鲁氏菌：
革兰阴性， 长约0.6-1.5μm, 宽约0.3-0.6μm, 用柯氏染色染成红 色,无鞭毛、不形成 芽胞和荚膜。
1、形 态
布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短 杆状细菌；
宽约0.3—0.5微米、长0.6—1.5微米。电 镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种 菌和猪种菌为短杆状；
6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说， 羊种菌最小，牛种菌产次之，猪种菌较大；
布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。
2、染 色
（4） 细菌变异
布氏菌在各种理化因素作用下易发生变异; 即从光滑型（S）变为非光滑型——粗糙(R)
或粘液(M)状。 变异菌落常比光滑型稍长，表面有颗粒。
菌落颜色为灰白色或褐色，
（5） 抵抗力
布氏菌在合适条件下能生存很长时间，有 较高的抗灭活能力。
对湿热、紫外线和各种射线以及常用的消 毒剂、抗生素、化学药物比较敏感；
布鲁氏菌的发展史
年份
菌名
发现人
国家
宿主
1887 1897 1914羊种来自 牛种菌 猪种菌Bruce
马尔他
羊
Bang
丹麦
牛
Traun
美国
猪
1953
绵羊附睾种菌
Buadle
新西兰
公绵羊
1956 1966
沙漠森林鼠种菌 犬种菌
Stoennen Carmichael
美国 美国
沙漠森林野鼠 小猎犬
（一）病原学概述
3、培养特性
1.布鲁氏菌培养营养要求高：
需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需 要血清才能生长。
2.生长缓慢：一般需经4—6天，有的甚至21—30
天才能长出菌落。 3.生长所需温度：20—40℃，最适为37℃,超过 42℃则不生长。
4. C02: 绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格
的C02(5～10％)。
布鲁氏菌病原学、血清学诊断
疾病预防控制中心
主要内容：
1、布鲁氏菌病原学； 2、布鲁氏菌诊断标准； 3、布鲁氏菌血清学实验的几种方法。
（一）布氏菌概述
1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英 国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌后，布鲁氏菌属 （Brucella)，包括6个种19个生物型。 羊种布氏菌（Br melitensis) 牛种布氏菌（Br abortus) 猪种布氏菌（Br suis) 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌（Br canis)
生存时间（天） 25—65 21—90 14—47 20—45 60—318 120 死亡 20—50
(1)对物理因子的抵抗力
物理因子对布氏菌的影响
物理因子 湿热56℃ 湿热63℃ 湿热80℃ 湿热90℃ 湿热100℃
生存时间 60分钟以上 60分钟以上 30分钟以上 10分钟以上 半分钟死亡
物理因子 干热80℃ 干热90℃ 干热100℃ 直射阳光 散射阳光
布鲁氏菌属（Brucella) 包括6个种19个生物型。
牛种布氏菌（Br abortus) ： 1、2、3、4、5、6、7、9型 羊种布氏菌（Br melitensis) ：1、2、3型 猪种布氏菌（Br suis) ： 1、2、3、4、5型 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌 （Br canis)
（二）布鲁氏菌分离培养
采用何种方法、 取何种材料、 何种培养基 实验室条件
布氏菌的分离培养
一、从可疑病人分离布氏菌 血培养： 30天未培养出菌，可定位阴性 。 骨髓培养：抽取骨髓（接种双相培养基） 尿培养： 其他病原材料培养:乳、脑脊液、关节液
和滑囊液分离布氏菌，参照血培养观察 结果，15天不长菌定为阴性
出菌材料有血液、关节液、滑囊液、骨髓、脑髓液、胸 液、淋巴结、乳汁、脓汁、胆汁、尿、阴道分泌物、等 20余种。
由于取材难易等原因，人多由血液、关节液、滑囊液、 骨髓出菌；羊多由流产羔、胎盘、死羔检出菌；牛多由 流产犊、乳汁检出菌；猪多由流产仔猪、胎盘出菌。
二、从牲畜材料中分离布氏菌
从牲畜流产羔检菌：
从胎衣检菌：
从阴道分泌物检菌：
尿液检菌：
乳汁检菌：
脓汁检菌：
血液培养：
脏器检菌：
我国出菌宿主及材料
我国从人、羊、牛、猪、犬、鹿、马、骆驼等家畜及黄 羊、岩羊、黄鼠、黄胸鼠等野生动物检出布氏菌。从牧 区水塘水和羊毛中也检出过布氏菌。
──────────────
(%) 羊型 牛型 猪型
──────────────────
石碳酸
1
≤5 ≤3 ≤5
石碳酸
2
1
2
1
来苏儿
2
≤3 ≤1 ≤3
来苏儿
3
瞬间 瞬间 瞬间
漂白粉澄清液
0.2
1-2 瞬间 瞬间
漂白粉乳剂
2.5
1-2 瞬间 瞬间
肥皂水
2
≥20 ≥20 ≥20
─────────────────────────────
生存时间 60分钟以上 60分钟以上 7分钟以上 1～4小时 7～8天
(2)对化学因子的抵抗力
化学因子对布氏菌的影响
药物名称 新洁尔灭 石炭酸 来苏儿 来苏儿 氯亚明 氯亚明 升汞
浓度(%) 0.1 1～2 2 3 0.2 0.5 0.05
生存时间 30秒钟 1～5分钟 1～3分钟 1分钟以内 5～7分钟 3～5分钟 1分钟以内
对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷 冻真空干燥法保存菌种。
布氏菌在自然条件下的生存能力
自然条件 水 尘 粪 畜舍墙棚 地面 衣服 皮毛 鲜牛乳
生存时间（天） 50—120 4—120 21—72 4—150 4—150 30—80 45—120 2—550
自然条件 奶油 奶酪 冻肉 腌肉 培养基 干燥胎膜 腐败脏器 人工胃液