人膀胱癌细胞原代培养及体外药物敏感性实验研究_王剑松

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌中约５５％～６０％为浅表性膀胱癌，其中５０％～７０％术后出现复发，约２５％～３０％的复发病例伴有恶性程度增高或浸润能力增强。

到目前为止已有３０多种药物用于临床，包括细胞毒药物、免疫调节剂和维生素等，但仅有少数几种药物较为有效［１］。

近年来，人们试图摆脱膀胱肿瘤的“菜谱式”治疗，通过药物敏感实验，建立“量体裁衣式”的治疗方法。

而其中四氮唑蓝（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）比色分析法是目前最常用的体外肿瘤药敏试收稿日期：２００８－０１－０７修订日期：２００８－０２－２６作者简介：王剑松（１９６３～）男，教授，主要从事泌尿外科临床与基础研究。

项目研究：云南省科技攻关项目（２００２ＮＧ－１８）子课题。

・论著・人膀胱癌细胞原代培养及体外药物敏感性实验研究王剑松１，卢永伟２，王超３，詹辉１，袁龙４（１．昆明医学院第二附属医院泌尿外科，云南省泌尿外科研究室，云南昆明６５０１０１；２．福建省肿瘤医院；３．华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科；４．河南省肿瘤医院外科）摘要：目的研究不同个体表浅性膀胱癌组织对抗癌药物及其联合应用的敏感性。

方法采用肿瘤细胞原代培养技术和ＭＴＴ比色法测定了５９例膀胱癌组织对灌注抗癌药物及其联合应用的抑制率和敏感性。

结果１４例失败，４５例获得成功，总体可评价率为７６．３％，不同个体对不同抗癌药物的抑制率存在明显差异；除ＭＴＸ对膀胱癌Ｇ１和Ｇ３级平均抑制率差异有统计学意义外，其它抗癌药物对不同个体膀胱癌细胞的平均抑制率与膀胱癌的病理分级、分期均无关；抗癌药物对初发膀胱癌的敏感率和平均抑制率均高于复发膀胱癌；２种不同作用机制的抗癌药物联合应用对不同个体膀胱癌细胞的敏感率和平均抑制率均高于单一药物，二者敏感率和平均抑制率差异有统计学意义。

结论应根据药敏结果，选择相对敏感的抗癌药物，并将作用于不同机制、细胞不同周期的抗癌药物联合，制订个体化膀胱灌注治疗方案，以提高疗效，最大限度减少副反应，减少肿瘤复发率。

关键词：膀胱肿瘤；癌细胞体外培养；抗癌药物敏感实验中图分类号：Ｒ７３７．１４文献标识码：Ａ文章编号：１００６－４１４１（２００８）０３－０２２６－０４Ｐｒｉｍａｒｙｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＷＡＮＧＪｉａｎ－ｓｏｎｇ，ＬＵＹｏｎｇ－ｗｅｉ，ＷＡＮＧＣｈａｏ，ｅｔａｌ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｒｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌ－ｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ６５０１０１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｒａｔｅｓｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎ５９ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｔｕｍｏｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＭＴＴａｓｓａｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＯｆ５９ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｓａｍｐｌｅｓ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｐｅｒｆｏｒｍｅｄｉｎ４５ｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓｆａｉｌｅｄ，ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｒａｔｅｗａｓ７６．３％．ＤｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｒａｔｅｓｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｅｘｃｅｐｔＭＴＸｉｎｓｔａｇｅｏｆＧ１ａｎｄＧ３．Ｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈａｄｂｅｅｎｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｇｒａｄｅａｎｄｓｔａｇｅ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｍｅａｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｒａｔｅｓｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓｉｎｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｇｒｏｕｐｗｅｒｅｎｏｔａｂｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｒｅｃｕｒｒｅｎｔｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｔｈｅｒａｐｙａｇｅｎｔｓ，ｗｈｉｃｈｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅｔａｒｇｅｔｓ，ｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｅｒｍｅａｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｒａｔｅｓｔｈａｎｓｉｎｇｌｅｏｎｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｒｕｇｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｈｏｕｌｄｂｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｓｏａｓｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔ，ｄｅｃｒｅａｓｅｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓｔｏｔｈｅｌｅａｓｔ，ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｔｕｍｏｒｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ａｎｔｉｔｕｍｏｒｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ验方法，它是在１９８３年由Ｍｏｓｍａｎｎ首先应用于鼠淋巴瘤细胞系中研究ＩＬ－２等细胞因子对细胞存活和增殖的影响［２］。

本研究以人膀胱癌细胞为研究对象，采用ＭＴＴ法检测膀胱癌细胞体外药物敏感性，并比较不同个体膀胱癌细胞对不同抗癌方案的敏感性，以期为临床合理用药提供依据。

材料与方法一、实验材料标本取自２００５年４月～２００６年２月接受手术治疗的５９例膀胱癌患者。

男性３８例，女性２１例；年龄３５～９２岁，平均６７．７岁；均经手术探查病理确诊为膀胱移行细胞癌。

分级：Ｇ１２１例，Ｇ２１９例，Ｇ３１９例。

分期：Ｔａ期１８例，Ｔ１期４１例。

初发４４例，复发１５例。

采用的实验药物有：ＣＴＸ－１２（蛇毒膜毒素－１２），ＨＣＰＴ（羟基喜树碱），ＭＴＸ（氨甲蝶呤），ＥＰＩ（表阿霉素）和ＤＤＰ（顺铂）等。

抗癌药物试验浓度以生理盐水配成浓度为１ｍｇ／ｍｌ的溶液，－３０℃冻存（不超过３个月），临用前解冻。

二、实验方法采用细胞原代培养方法：肿瘤标本均取自手术切除的新鲜癌组织，进行原代细胞培养，利用肿瘤细胞贴壁比成纤维细胞慢的特点，用短暂培养反复贴壁的方法将二者分开［３］。

通过光镜下细胞形态学特点观察及免疫组织化学检验，对培养肿瘤细胞进行生物学鉴定，确定系移行上皮肿瘤。

对原代培养细胞进行ＭＴＴ比色法药敏实验操作：参照Ｍｏｓｍａｎｎ［３］的方法略加修改，将上述细胞悬液（５×１０５／ｍｌ）接种于９６孔无菌培养板，每孔１００μｌ（含５×１０４个细胞）。

设无药对照孔、空白对照孔和测定孔，每种药物均设３个复孔，置入３７℃，５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后，弃去上清液，测定孔内加入不同浓度的各组化疗药物１００μｌ（ＣＴＸ－１２，ＨＣＰＴ，ＭＴＸ，ＥＰＩ，ＤＤＰ，ＣＴＸ１２＋ＨＣＰＴ，ＣＴＸ１２＋ＭＴＸ，ＣＴＸ１２＋ＥＰＩ及ＣＴＸ１２＋ＤＤＰ），空白对照孔加入含１０％小牛血清等量的ＲＰＭＩ－１６４０完全培养液，３７℃，５％ＣＯ２，重新放入培养箱中培养２ｈ后取出，去上清液，每孔加入不含血清的ＲＰＭＩ１６４０液配成的ＭＴＴ液１００μｌ，５％ＣＯ２条件下继续培养４ｈ，去上清，每孔加入ＤＭＳＯ１００μｌ，轻度震荡溶解甲攒（ｆｏｒｍａｚａｎ）结晶１０～１５ｍｉｎ，使紫蓝色甲臜结晶完全溶解，即在酶标仪上测定波长５７０ｎｍ为检测波长，测各孔的ＯＤ值。

根据下列公式计算抑制率：１－（药物组ＯＤ值－空白组ＯＤ值）／（无药对照组ＯＤ值－空白组ＯＤ值）×１００％；肿瘤细胞的存活率＝１－肿瘤细胞的抑制率。

采用１９７８年全国抗癌药物会议制定的抗肿瘤药物通用指标：对膀胱癌细胞的抑制率（ＩＲ）＞７０％为高度敏感，５０％～７０％为中度敏感，３０％～４９％为低度敏感，＜３０％为不敏感或耐药，并选择抑制率最高的化疗药物供临床治疗参考［４］。

统计学处理：选用ＳＰＳＳ１０．０统计软件包进行数据处理，数值以均数±标准差表示，组间比较用配对ｔ检验，其余用单因素方差分析检验，各组结果以α＝０．０５为检验水准。

结果一、形态学观察１．相差显微镜观察：筛选原代培养细胞，４８～７２ｈ后贴壁生长的细胞数量明显增多，并可见有较长突起的成纤维细胞，当培养至第５～７ｄ时，细胞已大部分融合，长满瓶底。

２．组织学观察（Ｇｉｅｍｓａ染色）：肿瘤细胞贴壁生长，呈上皮样，细胞形态和大小有差异。

多呈圆形及多角形，细胞核大。

核仁清晰，多为２～３个。

胞浆内可见颗粒和空泡，细胞失去接触抑制并易脱落。

可见有较长突起的成纤维细胞，经过纯化后，有较长突起的成纤维细胞较少或不见。

二、生物学特征检测细胞角蛋白２０（Ｃｙｔｏｋ－ｅｒａｔｉｎ２０，ＣＫ２０）特异地分布于上皮细胞及其来源的肿瘤，而正常膀胱组织无表达［５］。

免疫组化检查结果：免疫组化染色肿瘤细胞染色阳性，胞浆呈黄色，胞核呈蓝色。

非肿瘤细胞染色阴性。

三、药物敏感性检测１．用ＭＴＴ法对５９例膀胱癌标本进行体外药敏试验，１４例失败，４５例获得成功，总体可评价率为７６．３％。

２．抗癌药物对不同个体膀胱癌细胞抑制率的比较，通过对４５例膀胱癌细胞的抗癌药物敏感性实验，发现抗癌药物对不同个体膀胱肿瘤细胞的抑制率差异很大，ＭＴ１２的抑制率为７．４％～８５．７％，ＨＣＰＴ的抑制率为３．７％～８５．７％，ＭＴＸ的抑制率为２．０％～７２．１％，ＥＰＩ的抑制率为２．０％～９４．５％，ＣＤＤＰ的抑制率为０～８９．２％。

３．膀胱癌病理分级、分期与抗癌药物抑制率的关系：分别对ＣＴＸ－１２，ＨＣＰＴ，ＭＴＸ，ＥＰＩ，ＤＤＰ，ＣＴＸ１２＋ＨＣＰＴ，ＣＴＸ１２＋ＭＴＸ，ＣＴＸ１２＋ＥＰＩ及ＣＴＸ１２＋ＤＤＰ各单药及两药联合的检测发现在４５例膀胱癌中，除ＭＴＸ对膀胱癌Ｇ１和Ｇ３级平均抑制率差异有统计学意义外（Ｐ＜０．０５），其余抗癌药物对不同个体膀胱癌细胞的平均抑制率与膀胱癌的病理分级、分期均无关（Ｐ均＞０．０５）。

４．抗癌药物对膀胱癌的初发与复发平均抑制率的比较：在３５例初发膀胱癌和１０例复发膀胱癌中，抗癌药物对其敏感率和平均抑制率均不同，抗癌药物对初发膀胱癌的敏感率和平均抑制率均高于复发膀胱癌，且二者平均抑制率差异有统计学意义（Ｐ均＜０．０５）。